【摘 要】
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弧菌病是虾养殖过程中面临的主要威胁。目前,还不清楚弧菌是如何穿透富含几丁质的虾壳和胃肠道,进而侵入虾宿主的过程。几丁质酶是一类能水解几丁质β-1,4糖苷键的糖苷水解酶,长期被认为是弧菌的重要毒力因子,但缺少直接的证据。本课题从虾生活环境出发,筛选获得一批具有降解几丁质能力的微生物,其中包括弧菌属细菌,实验评估了几丁质降解菌的降解能力。课题针对得到的虾类主要病原细菌（三株不同种的弧菌）:溶藻弧菌、哈
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弧菌病是虾养殖过程中面临的主要威胁。目前,还不清楚弧菌是如何穿透富含几丁质的虾壳和胃肠道,进而侵入虾宿主的过程。几丁质酶是一类能水解几丁质β-1,4糖苷键的糖苷水解酶,长期被认为是弧菌的重要毒力因子,但缺少直接的证据。本课题从虾生活环境出发,筛选获得一批具有降解几丁质能力的微生物,其中包括弧菌属细菌,实验评估了几丁质降解菌的降解能力。课题针对得到的虾类主要病原细菌（三株不同种的弧菌）:溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌几丁质利用展开研究,发现三株弧菌均不能以几丁质或虾壳为唯一碳氮源生长;然而,它们在添加了几丁质的LB固体培养基上生长良好,并且能有效降解几丁质（出现清晰水解圈）、LB培养基中添加的虾壳也能被弧菌有效降解。在3个弧菌基因组中有10个注释的胞外几丁质酶,包括9个糖苷水解酶18家族几丁质酶和1个溶解性多糖单加氧酶。其中9个几丁质酶的氮端或碳端,都发现了拷贝数为一或二个的3型碳水化合物结合域,这有助于酶定位并结合于几丁质底物结构。3型碳水化合物结合域是众多病原体毒力因子的重要结构域,且在进化上高度保守。RT-q PCR检测显示,这三种弧菌的10种几丁质酶基因对虾壳或胶体几丁质,能迅速作出响应:表达量均显著上调（Vpchi90响应几丁质在4 h有最高程度的上调,表达量增加33340.8.0倍）,并在培养上层清液检测出几丁质酶酶活。对这些弧菌基因在枯草芽孢杆菌中进行重组表达,其中来源于溶藻弧菌的r Va Chi89（0.58 U/m L）和副溶血弧菌的r Vp Chi90（0.91 U/m L）成功表达,并完成了酶学性质鉴定。r Va Chi89和r Vp Chi90能够有效降解虾壳,进一步提示了几丁质酶在虾壳侵入中可能起到了重要的作用。HPLC图谱显示,r Va Chi89和r Vp Chi90能将几丁质水解成为单糖Glc NAc和几丁寡糖（主要是DP5-7）,寡糖可被弧菌作为碳氮源利用。本研究表明弧菌几丁质酶可能是其侵入宿主的关键毒力因子,可作为控制弧菌疾病有价值的药物靶点,r Va Chi89和r Vp Chi90在几丁质生物废弃物回收中具有较好的应用潜力。
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