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乙型肝炎(简称乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的肝脏损害，是我国当前流行最广泛，危害性较严重的一种传染病。50％的肝硬化和70％-90％的肝癌是由慢性乙型肝炎病毒感染引起的。目前肝炎治疗尚无有效手段。因此，深入探讨肝炎发生机制，必将为预防和控制肝炎的发生和发展提供新型治疗手段。HBV感染人体后，其引起的肝脏和其他脏器的病变，以及疾病的发生、发展，并非病毒本身所致，而是与人体的免疫状态有一定的关系。研究认为：HBV感染的多种临床表现形式和转归主要取决于机体所产生的细胞免疫应答的强弱及活跃程度。在机体的细胞免疫应答过程中，Th细胞在调节细胞和体液免疫应答中起关键作用。初始CD4+Th细胞分化后可产生至少两种表型与功能不同的效应细胞亚群：Th1与Th2细胞，它们是免疫调节的核心。Th1细胞主要诱发细胞免疫反应，杀伤胞内病原体(包括病毒、细菌、寄生虫等)，诱导迟发型超敏反应；Th2细胞刺激B细胞增生，产生相应抗体，诱发体液免疫反应以清除胞外病原体，防止胞内感染的扩散。同时，Th1和Th2细胞之间存在相互拮抗的关系。在HBV感染的过程中，研究发现Th1细胞分泌的细胞因子通过直接或间接作用增强NK细胞、巨噬细胞，特别是CD8+T细胞活性，促进细胞免疫反应，有利于清除病毒，同时加重肝细胞的炎症损伤。反之，Th2细胞分泌的细胞因子将促进体液免疫反应，并抑制细胞免疫应答。因而调控T淋巴细胞应答，重建Th1／Th2细胞亚群平衡，有望成为治疗病毒性肝炎的有效手段。Tim(T cell immuglobulin domain and mucin domain)基因编码的蛋白是一类具有共同基序的跨膜糖蛋白，其基本结构包括一个信号肽、免疫球蛋白样区、粘蛋白样区、跨膜区和有磷酸化位点的胞内区。Tim家族位于人染色体5q32.2，共包括3个基因，分别是Tim-1，Tim-3及Tim-4。现已发现Tim家族参与Th细胞的分化及免疫应答调节，在一些自身免疫性疾病的发生和发展及诱导外周免疫耐受和移植耐受中起着重要作用。Tim-1主要表达在活化的初始T细胞表面及分化后的Th2细胞表面，为T细胞的活化提供协同信号，并促进细胞因子的分泌；Tim—3主要表达在分化后的Th1细胞表面，负调节Th1细胞介导的免疫应答。HBV感染人体的过程中，Tim—1、Tim—3是否参与其中目前尚未见报道。本研究通过荧光实时定量RT-PCR及半定量RT-PCR检测乙肝患者外周血单个核细胞(peripheral blood monoculear cells，PBMC)Tim-1、Tim-3 mRNA的表达水平，探讨Tim—1、Tim—3表达与乙肝各临床指标的相关性，为进一步阐明乙肝的发病机制及Tim家族分子在乙肝发生中的作用奠定基础。结果发现，急性乙肝患者外周血PBMC中Tim-3mRNA的表达显著高于慢性乙肝患者(P＜0.05)和健康对照者(P＜0.01)，慢性乙肝患者外周血PBMC中Tim-1及Tim-3mRNA的表达均显著高于健康对照者，且Tim-3 mRNA的表达与ALT呈正相关。本研究结果提示，新型免疫分子Tim—1、Tim—3可能参与了乙肝的发病和慢性化过程；而且Tim-3有可能成为临床监测慢性乙肝炎症活动程度的新指标。目的通过荧光实时定量RT-PCR及半定量RT-PCR分析乙肝患者与健康对照者PBMC中Tim-1、Tim-3在mRNA水平的表达差异，探讨Tim分子在乙肝发生发展中的作用，并进而为阐明乙型肝炎发病机制提供新依据。材料与方法1病例的选择与标本的收集于2005年6月至2005年9月间，从济南市传染病医院住院病人随机采集乙肝患者外周静脉血，共计63例，年龄在16-69岁之间，平均35岁，其中男性57人，女性6人。所有病例均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》诊断分型标准。根据临床诊断标准共分三组：急性乙型肝炎组4例，慢性乙型肝炎组44例，肝硬化组15例。同时，从济南市中心医院健康查体中心选取性别和年龄相匹配的健康对照组34例，其HBsAg均为阴性，肝功正常。另外取B超诊断单纯性脂肪肝病人组9例，其HBsAg均为阴性，肝功正常。2方法2．1荧光实时定量PCR及半定量RT-PCR检测Tim-1、Tim-3 mRNA表达从PUBMED数据库下载人Tim-1、Tim-3的cDNA序列，根据引物设计原则，应用Premier Primer 5.0引物设计软件设计引物，为避免基因组DNA污染，所设计引物均跨不同外显子。通过荧光实时定量RT-PCR及半定量RT-PCR检测健康对照者与乙肝患者新鲜分离的PBMC中Tim-1、Tim-3 mRNA表达。2．2全自动生化分析仪(7170s)检测肝脏功能指标(丙氨酸氨基转移酶ALT)ALT检测均采用酶速率法。在7170s生化分析仪上检测，结果以U／L报告。2．3美国ABI公司荧光实时定量PCR检测患者血清乙肝病毒载量(HBV DNA)2．4统计学方法：实验数据以(?)±s表示。用SAS统计软件，以One way ANOVA分析各组别之间的差异，各组间的比较采用q检验。结果1荧光实时定量PCR及半定量RT-PCR检测Tim-1、Tim-3表达为保证试验结果的准确性，在本实验研究中，分别采用两种方法检测人Tim-1及Tim-3 mRNA表达，并比较其一致性。结果发现，常规RT-PCR扩增人Tim-1及Tim-3，经2％琼脂糖凝胶电泳观察Tim-1为单一条带，Tim-3为两条条带，分别为全长膜型Tim-3(fTim-3)和可溶性Tim-3(sTim-3)。荧光实时定量PCR分析得到的三种目的基因条带融解曲线良好，没有非特异性条带扩增，特异性高。比较两种分析方法所得结果，一致性良好。2 Tim-1、Tim-3 mRNA在不同临床类型乙肝患者外周血PBMC中的表达对63例乙肝患者和34例正常对照标本分别进行荧光定量RT-PCR分析，结果表明：慢性乙肝患者外周血PBMC中Tim-1表达值为：1.405±0.6307，显著高于健康对照者(0.8908±0.3881)(t检验，P＜0.01)，急性乙肝患者Tim-1表达值为：2.381±1.05，与健康对照者相比无显著性差异(t检验，P=0.20)。(见图2-1)急性乙肝、慢性乙肝患者外周血PBMC中Tim-3的表达值分别为1.48±0.6724和1.502±0.7619，显著高于健康对照者(0.7294±0.6297)(t检验，P＜0.01和P＜0.05)；急性乙肝Tim-3 mRNA的表达显著高于慢性乙肝患者Tim-3mRNA的表达(P＜0.05)。(见图2-2)3慢性乙肝患者外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表达与丙氨酸氨基转移酶(ALT)的相关性分析慢性乙肝患者外周血Tim-1、Tim-3 mRNA的表达与ALT的相关性分析表明，Tim-3 mRNA的表达与ALT呈正相关，r=0.317，P＜0.05；Tim-1mRNA的表达与ALT无相关性，r=0.169，P=0.14。4慢性乙肝患者外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表达与血清中乙肝病毒载量(DNA)的相关性分析慢性乙肝患者外周血Tim-1、Tim-3与血清中HBV病毒载量的相关性分析表明，Tim-1 mRNA的表达与血清中HBV病毒载量具有负相关性，r=0.357，P＜0.05；Tim-3 mRNA的表达与血清中HBV病毒载量无相关性。5慢性乙肝患者外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表达与HBeAg(+)／HBeAg(-)的相关性HBeAg阳性和HBeAg阴性慢性乙肝的病原学、流行病学和临床特点、预后及治疗策略有很大区别，因此根据乙肝患者外周血病毒标志物HBeAg将慢性乙肝病人分为两组，分别分析Tim-1、Tim-3 mRNA在HBeAg(+)组／HBeAg(-)组的表达，结果发现Tim-3 mRNA在HBeAg(-)组的表达显著高于HBeAg(+)组，P＜0.05，而Tim-1 mRNA在两组的表达差异无显著性意义。6慢性乙肝患者治疗前后外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表达对比分析在慢性乙肝组病人中，通过分析同一个病人治疗前后Tim-1、Tim-3 mRNA的表达(4组)发现，治疗后伴随肝功能的改善，ALT下降，Tim-3表达也随之下降。Tim-3与ALT具有良好的相关性，这与前面的结果是一致的(结果3)。结论本研究结果提示，在乙肝的发病和慢性化过程中，Tim—1、Tim—3参与了疾病的发生和发展过程；慢性乙肝患者外周血中Tim-3 mRNA的表达与ALT呈正相关，Tim-3有可能成为临床监测慢性乙肝炎症活动程度的新指标。