细胞信号转导与有机磷迟发性神经病变的关系研究

来源 :山东省医学科学院 | 被引量 : 2次 | 上传用户:lpwxlwan
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【目的】分别以甲胺磷和磷酸三甲苯酯诱发母鸡迟发性神经病(OPIDN),观察病理学改变及超微结构的变化,测定神经病靶酯酶的改变及有关生化指标的变化,检测大脑信号转导途径中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相关蛋白2和β-actin的动态变化趋势,阐明甲胺磷和磷酸三甲苯酯诱发OPIDN过程中不同信号蛋白含量水平的改变,为进一步探讨细胞信号转导途径在OPIDN发生中的作用机制提供依据。【方法】健康成年母鸡(鲁禽种鸡)44只,适应性喂养1周后,将动物按体重随机分为甲胺磷造模组(n=20),磷酸三甲苯酯造模组(n=20)和对照组(n=4)。甲胺磷造模组经口给予甲胺磷10mg/(kg·d),连续给药14天;磷酸三甲苯酯造模组经口给予磷酸三甲苯酯原油1ml/(kg·d),连续给药7天,诱发迟发性神经毒性。对照组动物连续14天经口给予生理盐水1ml/(kg·d)。甲胺磷组、磷酸三甲苯酯组和对照组母鸡于染毒后7d、14d、21d、28d断头处死,取血清备用。迅速取出脑、脊髓、坐骨神经和腓肠肌,按照常规要求制备病理及电镜标本。动物血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的含量采用试剂盒进行测定,采用自动生化仪测定胆碱酯酶(CHE)、钙(Ca)的含量。神经病靶酯酶(NTE)活性的测定采用经典的酶抑制差异测定法。采用Western blotting检测了大脑中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相关蛋白2和β-actin的动态变化趋势。【结果】1. OPIDN动物模型的建立和病理观察本实验中甲胺磷组经口小剂量(10mg/kg)多次累计染毒至5倍LD50以上,60%可出现OPIDN的典型症状,染毒后急性症状表现重,但是不给予保护剂,仍可度过急性期。磷酸三甲苯酯造模组的动物,染毒后急性症状轻,进食尚可,连续7天给予原油1ml/(kg·d),停药后7-10天全部出现典型的OPIDN。甲胺磷诱导的OPIDN母鸡神经组织在出现OPIDN症状21d时可见到轴浆内结构融解现象,髓鞘成气泡样变,髓鞘的损伤变化随时间的延长也逐渐加重, 28d时可见多处板层松散、破裂甚至崩解。同时观察到磷酸三甲苯酯诱导的OPIDN母鸡神经组织也呈现类似改变,这些变化也与临床表现相一致。2.动物血清中生化指标的测定甲胺磷组动物血清谷丙转氨酶(ALT)的含量在染毒结束后的7d、14d、21d均显著高于对照组(P<0.05),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d和14d均显著高于对照组(P<0.01)。磷酸三甲苯酯组动物血清谷草转氨酶(AST)的含量在染毒结束后的14d至28d均显著高于对照组(P<0.05)。甲胺磷组和磷酸三甲苯酯组动物血清胆碱酯酶(CHE)的含量在7d、14d、21d和28d均显著低于对照组(P<0.05)。甲胺磷组动物血清钙的含量在染毒结束后的21d、28d均显著高于对照组(P<0.05),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d显著高于对照组(P<0.05)。3.神经病靶酯酶(NTE)活性的测定甲胺磷组和磷酸三甲苯酯组动物神经病靶酯酶(NTE)的活性在染毒结束后的7d、14d、21d、28d均显著低于对照组(P<0.01)。4. OPIDN动物大脑中蛋白激酶、β-actin、微管相关蛋白2含量的变化甲胺磷组动物大脑中蛋白激酶C(PKC)含量在染毒结束后的7d、14d、21d、28d分别降低了24%(P<0.05)、28%(P<0.05)、30%(P<0.05)、62%(P<0.01),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d、14d、21d、28d分别降低了64%(P<0.01)、58%(P<0.01)、58%(P<0.01)、43%(P<0.05)。甲胺磷组和磷酸三甲苯酯组动物大脑中蛋白激酶A(PKA)的含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,甲胺磷组动物大脑中β-actin含量在染毒结束后的14d升高了30%(P<0.05),磷酸三甲苯酯组的动物在染毒后的第7d降低了26%(P<0.01)。甲胺磷组动物大脑中微管相关蛋白2(MAP-2)含量在染毒结束后的14d、28d均显著高于对照组(P<0.01),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d、14d、21d均显著高于对照组(P<0.01)。【结论】1.工业用磷酸三甲苯酯可建立鸡迟发性神经病(OPIDN)的良好动物模型,甲胺磷经口小剂量多次染毒可建立OPIDN动物模型,在未给予保护剂的情况下,造模的成功率较以往有很大提高。两组动物的神经组织均出现脱髓鞘等明显的神经损害。2. OPIDN发生并进展时,钙离子含量的显著改变,提示钙离子的含量变化与OPIDN的发生有相关关系。3.沿用经典的方法对NTE的抑制进行监测,NTE在OPIDN进展中被明显抑制,但其检测还存在底物稳定性不佳等局限性。4. Western blotting方法在大脑未发现PKA含量的改变,在今后的试验中应当对其他的神经组织进行进一步的研究。PKC含量的降低出现在OPIDN的进行阶段,可以考虑其是否可作为OPIDN发生发展的生物标志物。甲胺磷和磷酸三甲苯酯对蛋白的影响表现有差异性,对MAP-2和PKC含量的改变明显显著于β-actin。动物大脑中MAP-2含量的明显改变提示微管的结构和功能受到影响。
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