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目的:急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是目前临床上经常见的一种能危及生命的呼吸系统疾病。在复杂的发病机制中,血管通透性的增加可能引起肺水肿,最终导致呼吸衰竭,而内皮多糖包被完整性破坏是导致血管通透性增加的重要因素。虽然多年来许多新的治疗策略已经被开发出来,但ARDS患者的发病率及死亡率仍较高,严重威胁人类的健康。因此,继续开发有效的治疗药物是非常需要和迫切的。小檗碱(Berberine,BBR),又称黄连素,主要是从黄连中提取的一种异喹啉类生物碱,已经有研究报道小檗碱具有多效的药理学活性,如抗菌、抗炎、抗氧化等。除此之外,小檗碱对高血脂、高血糖等疾病模型还具有较好的改善作用。本实验以C57BL/6小鼠和HUVECs(人脐静脉内皮细胞)为研究对象,从抗氧化,抑制HPA、MMP9的表达以及抗炎等方面来探讨小檗碱(BBR)对脂多糖诱导的急性呼吸窘迫综合征中内皮细胞多糖包被的保护作用,并对其潜在的机制研究进行探讨,为临床预防及治疗急性呼吸窘迫综合征提供新的理论依据。方法:1.BBR预处理:①体内实验:选用8-10周的健康雄性C57BL/6小鼠,将其随机分为5组,分别为:Control组(正常对照组)、LPS组(ARDS模型组)、BBR+LPS(小檗碱预处理组,50,100,and 200 mg/kg)。小檗碱预处理组的小鼠分别每天灌胃50,100,200 mg/kg的小檗碱溶液,而Control组和LPS的小鼠则每天给予相同剂量的生理盐水,所有实验组的小鼠均连续灌胃7天。7天后,LPS组、BBR+LPS(50,100,and 200 mg/kg)组分别腹腔注射 LPS(20 mg/kg),构建 ARDS模型;而Control组注射相同量的生理盐水。6 h后将各组小鼠处死,留取肺组织,血液,肺泡灌洗液等备用。采用HE染色技术及评分标准来观察肺组织的病理形态学改变;检测肺湿干比来评价肺损伤严重程度;采用EBD检测肺血管渗透性;采用相应的ELISA试剂盒测定肺泡灌洗液中炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的含量变化,以及肺组织中ROS、MDA的含量变化;采用Westernblot技术检测NF-κB信号通路中关键的调节蛋白(NF-κB/P65,IκBα及磷酸化的IκBα)水平及活化状态;采用IF检测肺组织内皮多糖包被以及乙酰酐素酶,基质金属蛋白酶9的表达情况。②体外实验:本实验选用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象。将其分为5组,分别为Control组(正常对照组)、LPS组(ARDS模型组)、BBR+LPS(小檗碱预处理组,1.25,2.5,and 5 μM)。小檗碱预处理组分别给予BBR(1.25,2.5,and 5 μM)预处理 1 h,然后,LPS 组与 BBR+LPS(1.25,2.5,and 5 μM)组分别加入LPS(1 μg/mL)刺激6h。6h后,采用活性氧荧光探针DCFH-DA检测细胞内总活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达;采用线粒体荧光探针MitsoxTM检测线粒体活性氧的表达;采用ELISA试剂盒检测细胞中MDA的含量变化。采用免疫荧光技术检测细胞中内皮多糖包被重要组分SDC-1,HS以及HPA,MMP9的表达情况。2.BBR后处理:①体内实验:实验选用健康雄性C57BL/6小鼠,将其随机分为6组,分别为Control组(正常对照组)、LPS组(模型组)、LPS自我修复组、BBR修复组(50,100,and 200 mg/kg)。分别对LPS组、LPS自我修复组、BBR 修复组(50,100,and200mg/kg)组的小鼠腹腔注射 LPS(20mg/kg),构建ARDS模型,正常对照组给予等量的无菌生理盐水代替。6h后,将LPS组小鼠处死,BBR修复组小鼠给予50,100,200 mg/kg的小檗碱溶液灌胃3天,而正常对照组和LPS自我修复组用等量的无菌生理盐水做相同处理,3天后,将各组小鼠处死,留取肺组织。采用免疫荧光技术检测肺组织中内皮多糖包被的表达量。②体外实验:选用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象。将其分为6组,分别为Control组(正常对照组)、LPS组(模型组)、LPS自我修复组、BBR修复组(1.25,2.5,and 5 μM)。LPS 组、LPS 自我修复组、BBR 修复组(1.25,2.5,and 5 μM)组分别加入LPS(1 μg/mL)刺激6h,6h后,LPS自我修复组换成等剂量的完全培养基继续培养12 h,而BBR修复组用加入不同浓度小檗碱(1.25,2.5,and 5μM)的完全培养基替代继续培养12 h,采用免疫荧光技术检测细胞中内皮多糖包被的表达量。结果:HE及伊文思蓝结果显示,小檗碱能够明显改善肺组织损伤并显著降低肺损伤评分,还可以降低肺毛细血管通透性的增加。此外,体内体外实验结果进一步表明小檗碱显著降低了 LPS诱导的ARDS小鼠肺组织中活性氧的生成,LPS刺激的胞内总活性氧及线粒体活性氧的表达,减少了氧化应激损伤及炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的释放,并抑制NF-κB信号通路的激活。免疫荧光结果表明BBR显著降低LPS诱导的ARDS损伤模型中HPA、MMP9的表达,从而缓解血管内皮细胞多糖包被的降解,保护了多糖包被的完整性。小檗碱后处理结果显示,小檗碱可以促进内皮多糖包被的修复。结论:本研究表明BBR预处理可以缓解LPS诱导ARDS小鼠肺组织(体内实验)和LPS刺激HUVECs模型(体外实验)中内皮细胞多糖包被的损伤,其对多糖包被的保护作用机制可能涉及抗氧化、抑制多糖包被特异性降解酶(HPA、MMP9)表达以及抗炎等方面。此外,研究还发现BBR后处理可促进LPS诱导ARDS小鼠肺组织(体内实验)和LPS刺激HUVECs模型(体外实验)中内皮细胞多糖包被损伤的修复。