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目的:探讨杆状病毒作为载体钠碘转运体(NIS)基因作为报告基因监测干细胞的可行性。
方法:通过Bac-to-Bac方法重组GFP及NIS杆状病毒(Bac–GFP 及Bac–NIS),以不同感染复数(MOI)的重组绿色荧光蛋白(GFP)基因杆状病毒(Bac-GFP)分别感染诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)、人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESC)及骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs), 分别通过荧光显微镜及流式细胞仪测定干细胞的感染效率及荧光表达强度、荧光显微镜观察干细胞的荧光表达时间以及台盼蓝染色法检测重组杆状病毒对干细胞的毒性。通过重组NIS基因杆状病毒(Bac-NIS)感染BMSCs,观察不同MOI的Bac-NIS对干细胞摄125I的影响;Bac-NIS感染的干细胞不同时间摄125I和摄99mTcO4-功能的动态测定以及感染干细胞摄125I的高氯酸钠抑制实验;同时还进行了Bac–NIS感染的干细胞数量与细胞摄碘的相关性研究。
结果:成功制备了重组NIS和GFP基因的杆状病毒,受CMV(巨细胞病毒)立早期基因启动子调控。重组GFP杆状病毒MOI为200时,通过荧光显微镜观察iPS、hESC的感染效率大约为12%、27%;BMSCs的感染效率和荧光强度随Bac-GFP MOI的增加而增加,当MOI为200时,细胞感染效率和荧光强度达最高,感染效率为84.2%,而MOI为100时细胞的感染效率即达78%;当MOI为400时,细胞死亡数与对照组7天内未见明显差异;感染的BMSCs的荧光表达随着时间逐渐降低,第5d可见74.6%的细胞表达,第12d仍有34.2%的细胞表达。
Bac-NIS感染的BMSCs放射性125I摄取随着MOI的增加而增加,MOI=200时,细胞摄碘达最高;而且细胞摄取的碘可随高氯酸钠浓度的增加而明显抑制;细胞动态摄碘实验显示,感染细胞的125I摄取随着时间逐渐增加,30min达高峰,随后逐渐排出;而感染细胞摄取的放射性高锝酸根(99mTcO4-)同样随着时间逐渐增加,30min达高峰,但高峰时间较125I维持相对较长,为15-45min,且排出也相对较慢。
Bac-NIS感染的BMSCs数量与细胞放射性计数之间呈显著的相关性,R2=0.99,表明通过放射性计数变化可间接表明BMSCs的数量,为活体内示踪和定量干细胞提供依据。
结论:重组杆状病毒可感染人类胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞,对骨髓间充质干细胞具有较高的感染效率,细胞毒性低,具有较长的表达时间,可有效地介导放射性碘和高锝酸根的摄取,对干细胞移植治疗移行、分布和存活的监测具有可行性。