论文部分内容阅读
研究背景和研究目的：肺癌(lung caneer)是最常见的肺原发性恶性肿瘤,近年来肺癌的发病率和病死率迅速上升。由于肺癌对当前常用铂类药物易产生耐药性,因此有必要研发新的铂类替代药物。Pt(0506)101是一种新合成的铂类化合物,本实验通过离体和整体实验研究了Pt(0506)101的抗肺癌作用及机制。方法：1.整体试验：建立裸鼠肺癌移植瘤模型,包括A549,H292等多种肺癌。Pt(0506)101尾静脉注射给药,每4天给药1次,共5次。顺铂和卡铂作为阳性对照药。每3天测量小鼠体重及肿瘤体积1次。给药结束后取肿瘤称重,并拍照。2.离体试验：采用MTT法检测Pt(0506)101对各种肿瘤细胞的体外细胞毒作用,流式细胞仪检测Pt(0506)101作用后的肺癌细胞A549、H292的细胞周期、凋亡率的变化。3.作用机制研究：1)在肺癌细胞A549、H292中加入不同浓度的Pt(0506)101,并以顺铂和卡铂作为阳性对照药,48h后检测凋亡蛋白以及信号通路相关蛋白表达情况。2)A549细胞中p53基因特异性敲除后,western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。3)JNK抑制剂(SP600125)、p38抑制剂(SB203580)、Erkl/2抑制剂(U0126)以及P13K抑制剂(LY294002)干预A549细胞后,western blot法检测Pt(0506)101诱导表达上升凋亡相关蛋白。4)超声冻融法提取并测定Pt(0506)101作用后A549细胞内GSH水平,并用流式细胞仪进一步检测ROS的表达情况。用抗氧化剂NAC干预后,测定细胞凋亡率。结果：1.整体试验结果：Pt(0506)101-30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg呈剂量依赖性地抑制裸鼠A549、H292肺癌移植瘤的生长,且与模型组比较有显著性差异,A549的肿瘤抑制率分别为31.00%、47.03%、64.64%；H292的肿瘤抑制率分别为45.53%、53.79%、65.41%。Pt(0506)101抗肺癌作用略弱于顺铂DDP-6mg/kg,与卡铂CBP-60mg/kg接近。2.离体试验结果：1)Pt(0506)101对A549、H292、H460等肺癌细胞株的细胞毒作用较强,虽然作用不及顺铂,却明显强于对卡铂。对顺铂耐药株A549/PPD的作用强度较顺铂强；而对正常肺上皮细胞株BEAS-2B,其作用强度比顺铂弱2倍,此外,Pt(0506)101对胃癌MGC-803, HGC-27具有很强的抗癌活性,提示Pt(0506)101在抗瘤作用方面有选择性。2)100gM Pt(0506)101预处理肺癌细胞48h能显著性促进A549,H292和LTEP-A-2三种肺癌细胞发生凋亡**(P<0.01),其效果和10μM顺铂和200μM卡铂作用相当。3)Pt(0506)101并不能引起肺癌细胞周期的改变,而阳性对照药(顺铂和卡铂)明显增加A549、H292细胞株细胞周期S期的细胞比例,减少G1期的细胞比例。提示Pt(0506)101引起细胞凋亡与细胞周期的阻滞无关。3.作用机制研究：1)Pt(0506)101呈浓度依赖上调p53、Fas、Bax等蛋白的表达,下调Bcl-2表达,显著性地提高Bax/B1-2的比例。2)用siRNA方法特异性敲除A549细胞p53基因后能有效抑制Pt(0506)101诱导表达上升的Fas和Bax,结果证明p53可能位于Fas,Bax的上游发挥作用。3)Pt(0506)101能激活p-JNK蛋白表达,而且只有JNK抑制剂SP600125能显著抑制Pt(0506)101诱导的凋亡蛋白的表达。提示Pt(0506)101可能通过SPAK/JNK信号通路诱发肺癌细胞凋亡。4)Pt(0506)101能显著降低A549细胞内GSH水平,升高ROS水平；抗氧化剂NAC干预后,能下调Pt(0506)101诱导表达上升的凋亡率。提示Pt(0506)101诱导升高细胞内的活性氧可能是抑制或杀死癌细胞一个十分重要的启动因子。结论：综上结果,Pt(0506)101尾静脉注射给药能抑制裸鼠肺癌移植瘤的生长。Pt(0506)101对肺癌细胞株具有较强的细胞毒活性；体外能诱导肺癌细胞发生凋亡。其作用机制可能通过激活ROS/JNK言号通路,上调凋亡相关蛋白p53, Fas, Bax,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达,从而减少肿瘤血管生成,阻止细胞粘附,阻遏肿瘤细胞生长促进肿瘤细胞凋亡。