前言:　　 砷是国际肿瘤研究机构(IARC)确定的人类致癌物，砷的主要暴露途径包括水、土壤和空气。全球约有2亿人受饮水型砷暴露的危害，据2005年的不完全统计，中国慢性饮水型高砷暴露人口已超过500万，慢性饮水型砷中毒是我国面临的重大公共卫生问题之一。因此很多研究都是针对饮水型砷暴露展开的，也都取得了相应的进展。但是由于砷暴露途径的多样性，砷中毒还存在其他的类型。在我国除饮水型砷中毒外，还包括燃煤型砷中毒，主要发生在贵州陕西等地区，一些居民在通风条件差的环境下使用煤做饭、取暖、烘干食物，引发了严重的区域性砷中毒。煤炭引起的砷中毒，是中国特殊的砷健康问题。除此之外，采矿活动也会导致严重的砷污染，在美国干旱和半干旱的西南地区，存在一些尾矿和冶炼厂，亚利桑那州的Hayden-Winkleman和Iron King Mine这两个矿附近，特别是其下风向地区的空气中，发现高砷的灰尘，因此美国环境保护局已经就这两个矿的砷问题进行重点监测。　　 流行病学调查显示砷暴露和人类多种疾病，例如膀胱、皮肤和肺部等多器官的肿瘤产生直接相关。一项在美国人群中进行的为期一年的流行病学调查发现，砷暴露所导致的肺癌病人超过了5000例。此外，很多研究发现砷暴露和许多肺部功能障碍，如慢性咳嗽、支气管炎和呼吸急促等症状的发生有着极大的关系。因此针对砷暴露对肺部健康的不利影响的研究有着很大的意义。如果我们呼吸的空气中含有高砷灰尘，那么砷就很可能对直接的靶器官肺部造成损伤。　　 莱菔硫烷（Sulforaphane，SFN，SF，又名萝卜硫素）是一种主要存在于西兰花和其他十字花科蔬菜中的异硫氰酸盐类物质。目前的研究发现，Sulforaphane可以有效地预防肝癌、肺癌等多种癌症的发生，是抗氧化、防癌、抗癌活性等最显著的化合物。由于Sulforaphane的这种抗癌抗氧化的特性，不禁让我们思索，Sulforaphane能否在阻止砷对机体产生氧化损伤的过程中产生一定作用。　　 Sulforaphane的另一广为人知的特性，即它是Nrf2(Nuclear factor erythroid2-related factor2)的激动剂。转录因子Nrf2活化可以激活细胞防御系统来缓解药物和污染物对机体的危害。这一过程主要是通过上调抗氧化反应元件（Antioxidant response element，ARE）来实现的，其中主要包括谷氨酸半胱氨酸连接酶(其有两个亚型γ-glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC/γ-glutamate cysteine ligase regulatory subunit，GCLM)，谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST），NAD(P)H醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase1，NQO1)和血红素单加氧酶1(Hemeoxygenase1，HO-1)。许多报告称，Nrf2的活化被认为可以保护人体，对抗癌症、神经退行性疾病，肺功能障碍和急性肺损伤等疾病。　　 很多细胞实验的证据已经证明Nrf2在对抗砷毒性的重要作用，一项在小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）中的实验发现，和Nrf2野生型(Nrf2-WT)小鼠胚胎成纤维细胞相比，砷对Nrf2敲除型(Nrf2-KO)小鼠的胚胎成纤维细胞的毒性作用更加明显。特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ)和Sulforaphane一样，也是Nrf2常见的激动剂，在UROtsa细胞中发现，这两者可以降低无机砷(Inorganic arsenic，iAs)和一甲基机砷（Momomethylated arsenic，MMA）对细胞的毒性作用。在肝细胞中也发现了Sulforaphane可以降低砷毒性这类相似的结果。此外，Nrf2的其他激动剂如硫辛酸、肉桂醛和冬凌草均被发现在不同细胞中可以对抗砷产生的毒性，对细胞起到保护作用。　　 在许多体内实验中也证实了Nrf2的保护效应，一项动物实验结果，Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠饮用含亚砷酸钠(Sodium arsenite，NaAsO2)的水6个月后，发现在Nrf2-KO小鼠中，发生的膀胱、肝脏和肺脏病理改变远多于Nrf2-WT小鼠。现已有人群通过吸入含砷的颗粒暴露于砷的情况存在，然而针对吸入方法暴露于砷的实验却很少在啮齿类动物中进行，因此通过吸入含砷颗粒染毒和激活机体Nrf2水平来探讨其对肺脏的病理影响有着重要的现实意义。　　 材料与方法:　　 一、动物模型的建立　　 1、小鼠的饲养　　 C57/BL6 Nrf2-WT基因型和Nrf2-KO基因型小鼠，年龄6-8周，4只一笼，饲养在聚碳酸酯鼠笼中，自由饮食（AIN-76A饲料）和饮水，12-12 h昼夜交替，室内温度在22±5℃，相对湿度在50±20％，由亚利桑那大学动物研究中心代为标准化饲养。　　 2、小鼠的分组　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠各分为4组:Con组、SF组、As组和As+SF组（Con组=单纯对照组，As组=As吸入式染毒组，SF组=SF干预组，As+SF组=As吸入式染毒合并SF干预组）。每组5只，共40只小鼠。　　 3、染毒颗粒的准备　　 染毒所用的含砷颗粒包括大小，直径和空气动力学等特性完全仿造于现实生活，合成的粉尘主要包括10％三氧化二砷（Arsenic trioxide，As2O3），背景粉尘来自美国亚利桑那州公路粉尘，平均直径约为2μm。　　 4、染毒和干预过程　　 一个完全模仿外界的空间建立起来，24 h持续存在浓度100μg/m3的可吸入颗粒物（砷含量为10μg/m3）。但为了减小染毒过程中小鼠的应激反应，将暴露程度减小为可吸入颗粒物4.8 mg/m3每天30 min。小鼠被置于全身染毒系统（CH Technologies）暴露14天。Sulforaphane(Sigma)采用腹腔注射（intraperitoneally，i.p.）的方式以10 mg/kg的剂量隔天注射直到为期14天的染毒结束，所有的40只小鼠均存活到实验结束。　　 二、小鼠支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage，BAL)的细胞分化分析　　 经14天砷吸入暴露染毒和Sulforaphane腹腔注射干预后，小鼠被麻醉，肺部经0.5 ml磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline，PBS）灌洗三次，收集的三次灌沈液中的细胞被重悬于PBS中，1500 rpm离心3 min后涂片和染色，显微镜下计数200个细胞用于细胞分化分析。数据通过Mean±SD(n=5)来表示。　　 三、小鼠支气管肺泡灌洗细胞因子的测量　　 小鼠经14天砷吸入暴露染毒和Sulforaphane腹腔注射干预后被麻醉，肺部用0.5 ml PBS灌洗三次，第一次的支气管肺泡灌洗液的上清被储存在-80℃的冰箱(Thermo)里直到测量细胞因子。细胞因子包括白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度采用eBioscience公司的IL-6和TNF-αReady-SET-Go试剂盒。数据通过Mean±SD(n=5)来表示。　　 四、小鼠肺部组织切片苏木素-伊蓝染色(Hematoxylin andEosin, H&E)　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠肺部于10％福尔马林中固定，30％-50％-75％酒精脱水，石蜡包埋，切成5μm组织切片经苏木素-伊蓝染色后，于光学显微镜(Nikon)下应用软件NIS-ELEMENTS F30拍照，分析其病理损伤情况。　　 五、小鼠肺部组织切片细胞凋亡检测　　 Nrf2-WT小鼠肺部于10％福尔马林中固定，30％-50％-75％酒精脱水，石蜡包埋，切成5μm组织切片经罗氏公司细胞凋亡检测程序试剂盒(In situ cell deathdetection kit)染色，之后用核染剂Hoechst3334(Cell Signaling Technology)为组织的细胞核染色。在荧光显微镜(Zeiss Observer)应用Z1 microscope with theSlidebook computer program下观察拍照，分析其细胞凋亡情况。　　 六、小鼠肺组织免疫印迹分析(Western Blot)　　 在支气管肺泡灌洗液收集之后，分离小鼠的肺部为三部分，一部分于液氮速冻，之后置于-80℃保存直至蛋白分析检测使用。小鼠肺组织于蛋白裂解液进行蛋白提取和制备后，200μg/孔于聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE），检测Nrf2,NQO1,HO-1,γ-GCS，p-65，P-p65和β-actin蛋白，应用成像系统扫描发光条带，并扫描灰度值进行分析。　　 七、小鼠肺组织免疫组织化学分析(Immunohistochemical，IHC)　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠肺部于10％福尔马林中固定，30％-50％-75％酒精脱水，石蜡包埋，切成5μm组织切片针对Nrf2蛋白进行免疫组织化学染色，并于苏木素复染后，光学显微镜下应用软件NIS-ELEMENTS F30拍照，观察Nrf2蛋白表达情况。　　 八、小鼠肺组织DNA氧化损伤检测　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠肺部于10％福尔马林中固定，30％-50％-75％酒精脱水，石蜡包埋，切成5μm组织切片针对多克隆抗体8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-Oxo-7，8-dihydro-2-deoxyguanosine，8-Oxo-dG)，购于Trevigen进行免疫组织化学分析。最后经苏木素复染后，于光学显微镜下应用软件NIS-ELEMENTS F30拍照，检测DNA氧化损伤。　　 九、逆转录-实时荧光定量核酸扩增检测系统(quantitativereal-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)　　 在支气管肺泡灌洗液收集之后，分离小鼠的肺部为三部分，一部分于液氮速冻，之后置于-80℃保存直至RNA分析检测使用。用TRIzol(Invitrogen)提取肺组织总RNA，总RNA经PrimeScript反转录酶和OligodT，Random6 mers，dNTP将等量的RNA(1μg)转录为cDNA。RNA逆转录为cDNA使用ABIPRISM7500 Sequence Detector(Applied Biosystems) PCR仪，引物设计如下:　　 NQO1: GGTAGCGGCTCCATGTACTC(forward);　　 AGACCTGGAAGCCACAGAAA(reverse)　　 HO-1:GAGCCTGAATCGAGCAGAAC(forward);　　 CTCGGCTTGGATGTGTACCT(reverse)　　 GCLM: TCCCATGCAGTGGAGAAGAT(forward);　　 AGCTGTGCAACTCCAAGGAC(reverse)　　 β-actin: AAGGCCAACCGTGAAAAGAT(forward);　　 GTGGTACGACCAGAGGCATAC(reverse)　　 IL-13: CAAGACCAGACTCCCCTGTG(forward);　　 AGGCCATGCAATATCCTCTG(reverse)　　 IL-4:CCAAGGTGCTTCGCATATTT(forward);　　 ATCGAAAAGCCCGAAAGAGT(reverse)　　 TGF-β:GACTCTCCACCTGCAAGACC(forward);　　 GACTGGCGAGCCTTAGTTTG(reverse)　　 MCP-1:CCCAATGAGTAGGCTGGAGA(forward);　　 TCTGGACCCATTCCTTCTTG(reverse)　　 实时荧光定量核酸扩增cDNA:变性过程，1个循环(95℃，3 min);扩增过程，40个循环(95℃，10 s，60℃，20 s，72℃，5 s)，溶解曲线测量，1个循环(95℃，5s,65℃，60s)，温度升高到97℃，5-10 acquisition/℃，降温过程(40℃，30 s)。实时荧光检测使用的Lightcycler PCR仪(Roche)和Roche480软件检测。基因表达的相对差异由基因的循环数（Ct值）计算得出，结果最终用看家基因β-actin校正。Nrf2-WT的对照组被设定为1。　　 十、统计学分析　　 采用SPSS16.0统计软件（芝加哥，美国）对数据进行分析。实验数据以均数((x)±sd)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)比较各实验组与对照组间的统计学差异，组间两两比较采用Dunnetts检验，以p＜0.05为差异具有统计学意义。　　 结果:　　 1、砷吸入式暴露和Sulforaphane干预下小鼠肺部Nrf2及其下游部分抗氧化物酶水平均呈升高趋势。　　 尽管在一些细胞系和饮水型暴露条件下，砷可以激动Nrf2使其水平升高已经得到证实，但是通过吸入式进行砷暴露，观察对Nrf2的影响没有许多诸如此类的研究。本实验检测了Nrf2-WT小鼠通过吸入式暴露于砷14天后的肺组织Nrf2及其下游部分基因的表达情况，免疫印迹分析和免疫组织化学分析均显示Nrf2蛋白明显升高。腹腔注射Sulforaphane的小鼠肺部Nrf2蛋白水平同样也呈升高趋势，但砷暴露同时合并Sulforaphane干预组Nrf2蛋白升高水平是最显著的。和Nrf2相似的结果，其下游基因包括NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白水平在三个组均出现升高情况，基本上As+SF组的升高是最明显的。和预期一致的，Nrf2-KO组的小鼠蛋白检测时无法检测到Nrf2，其下游基因NQO1、HO-1和γ-GCS水平也呈基础状态，免疫组化也未见Nrf2蛋白表达。在mRNA水平检测时，Nrf2-KO组的NQO1、GCLM和HO-1的mRNA水平均低于相应的Nrf2-WT组。　　 2、Sulforaphane能够降低砷吸入式暴露下小鼠肺部的病理损伤，氧化损伤和细胞凋亡。　　 肺组织学检查表明，Nrf2-WT和Nrf2-KO空白对照组的小鼠肺泡上皮细胞薄薄一层，而且只有少量浸润的炎症细胞。注射Sulforaphane对两组小鼠肺组织的形态没有明显影响。在Nrf2-WT和Nrf2-KO组均可见砷暴露导致肺泡间隔显著增厚，胶原沉积增加，成纤维细胞增殖，肺泡增生。此外，还可见一些浸润淋巴细胞。值得注意的是，在Nrf2-WT的SF组小鼠中，并没有观察到所有砷暴露组的变化，表明Sulforaphane是可以防止Nrf2-WT小鼠砷暴露造成的的肺组织的病理变化。相反，从Nrf2-KO的SF组小鼠的肺组织切片可以看出砷暴露的改变没有得到缓解，表明Sulforaphane对砷诱导的肺损伤的保护作用的是具有Nrf2依赖性的。　　 通过针对肺部8-Oxo-dG水平的免疫组化检测了砷导致的DNA氧化损伤情况。在Nrf2-WT和Nrf2-KO的砷暴露组均可见小鼠肺部切片的DNA氧化损伤增加。两组的Sulforaphane干预组均未见DNA氧化损伤，反而在Nrf2-WT的As+SF组，砷导致的DNA氧化损伤明显下降，说明Sulforaphane可以降低砷暴露导致的氧化损伤情况，不过在Nrf2-KO的As+SF组未见DNA氧化损伤降低的情况。　　 此外，用Tunel荧光检测了凋亡细胞情况，Tunel是针对凋亡细胞的细胞核进行染色的，在Nrf2-WT的Con组和SF组均未发现细胞凋亡的情况，As组和As+SF组均出现了凋亡细胞，但同时发现As+SF组的细胞凋亡情况明显少于As组。此外还用Hoechst染核来确定了Tunel荧光标记的细胞核特异性。　　 3、Sulforaphane能够缓解砷吸入式暴露下小鼠肺部炎症细胞的浸润。　　 典型的肺吸入有毒颗粒物的反应是炎性细胞的浸润。砷暴露后，Nrf2-WT和Nrf2-KO两组总的支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞数目明显增加。Sulforaphane的干预降低了Nrf2-WT小鼠支气管肺泡灌洗液的总细胞计数，但对Nrf2-KO的小鼠没有影响。Sulforaphane单独干预对Nrf2-WT或Nrf2-KO小鼠的肺不会引起任何炎症情况。对巨噬细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞的分别计数也得到了和细胞总数类似的趋势。总的来说，这些数据表明，Sulforaphane可以激活Nrf2使其能够抑制砷吸入引起的肺部炎症反应。　　 TNF-α是一种多功能的促炎细胞因子，可被砷暴露诱导增高。在这项研究中，通过ELISA分析检测发现砷吸入后支气管肺泡灌洗液中的TNF-α出现了增加的现象。有趣的是，Sulforaphane的干预明显着减少了Nrf2-WT小鼠的支气管肺泡灌洗液TNF-α的释放，但并不对Nrf2-KO小鼠产生影响。TNF-α不仅是转录因子NF-κ B的靶基因，也可以激活NF-κB途径，导致p65的第536位点的丝氨酸的磷酸化。p65是NF-κB的一类亚基，可以调节包括细胞因子，诸如IL-6，有助于修复炎症损伤和损伤肺部的重构。我们发现，砷吸入暴露后激活NF-κB信号通路，增强p65的磷酸化(P-p65)，而总p65没有发生变化。Sulforaphane的干预抑制了Nrf2-WT小鼠在砷暴露后磷酸化p65的增加，但对Nrf2-KO小鼠没有影响。支气管肺泡灌洗液中的IL-6在砷暴露后也呈增加趋势，这也证实了砷激活了NF-κB通路。Sulforaphane干预在Nrf2-WT小鼠中减低了IL-6的增长程度，但对Nrf2-KO小鼠没有影响。这之后的qRT-PCR检测mRNA水平进一步分析表明，砷暴露导致产生的Th2型细胞因子增加，包括IL-13和IL-4，在Nrf2-WT小鼠中，Sulforaphane可以抑制其增加趋势，但对Nrf2-KO小鼠不起作用（IL-13:统计学显著;IL-4:显著趋势）。此外，砷暴露导致转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）升高，同时升高的还有单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein1，MCP-1)，它是T淋巴细胞浸润的巨噬细胞和上皮细胞产生的趋化因子。Nrf2-WT小鼠的TGF-β和MCP-1在Sulforaphane的干预下，砷暴露组呈轻微下降趋势，Nrf2-KO小鼠未见变化。结合数据发现砷暴露使小鼠的支气管肺泡灌洗液中淋巴细胞增多，表明砷可以诱导过敏性肺部炎症反应。值得注意的是，Sulforaphane在Nrf2-WT小鼠中可以抑制砷诱导的Th2细胞因子（IL-13和IL-4）和MCP-1，但对Nrf2-KO小鼠没有效果，表示的Sulforaphane的抗炎活性是具有Nrf2依赖性的。　　 结论:　　 1、砷吸入式暴露和Sulforaphane干预下小鼠肺部转录因子Nrf2及其下游部分抗氧化物酶水平呈升高趋势。　　 2、Sulforaphane能够降低砷吸入式暴露下小鼠肺部的病理损伤，氧化损伤和细胞凋亡。　　 3、Sulforaphane能够缓解砷吸入式暴露下小鼠肺部炎症细胞的浸润。