PIG11基因在人脑胶质瘤细胞中的表达及对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

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目的探讨PIG11基因在人正常脑组织及不同级别胶质瘤组织中的表达水平及其对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响。方法收集30例胶质瘤和15例正常脑组织标本,利用RT-PCR法检测基因PIG11 mRNA的表达,分析不同级别胶质瘤及脑组织间PIG11mRNA表达水平的差异。以从人的胶质瘤组织中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增PIG11基因编码区cDNA,插入pEGFP-N1表达载体,构建重组体pEGFP-N1-PIG11,经酶切分析及测序鉴定插入正确后,脂质体介导将该重组体转染入U251细胞中,对转染后的细胞进行RT-PCR鉴定该基因在细胞中的表达、荧光显微镜观察该基因的亚细胞定位及转染效率;MTT检测转染后该基因对U251细胞增殖的影响:Hoechst染色、Tunel法、DNA Ladder、流式细胞仪检测该基因对胶质瘤细胞凋亡的影响。结果RT-PCR检测显示基因PIG11在正常脑组织、Ⅰ级和Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质细胞瘤中均有表达,其表达强度(ODPIG11/ODGAPDH)分别为0.95±0.20、0.71±0.15、0.39±0.16,随着胶质瘤级别的增高,表达强度逐渐降低,组内两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测、酶切分析、测序分析、荧光显微镜观察证实重组体pEGFP-N1一PIG11构建成功,并能高效率转染入U251细胞中。荧光显微镜观察显示PIG11为胞浆蛋白。MTT结果显示,PIG11基因过表达能显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖。DNA ladder检测转基因组出现梯形电泳条带,说明有较明显的细胞凋亡发生,空白对照组、空载体、脂质体组均未见梯形电泳条带。Hoechst荧光染色及Tunel染色结果显示转基因组细胞的细胞核的染色质高度浓染,部分细胞核裂解为碎块,符合凋亡的形态学的改变,Tunel法检测空白对照组、空载体、脂质体组和转基因组细胞的凋亡指数分别为:2.1±0.1%、2.5±0.2%、2.4±0.6%、19.5±1.5%,转基因组细胞调亡指数明显高于其余三组(P<0.05)。FCM检测结果显示空白对照组、空载体组、脂质体组和转基因组细胞凋亡率分别为1.8±0.2%、2.2±0.2%、2.0±0.3%和22.7±0.6%,转基因组细胞凋亡率均明显高于空白对照组、空载体组、脂质体组(P<0.05)。结论基因PIG11在人正常脑组织及胶质瘤组织中均有表达,高分化胶质瘤(Ⅰ级和Ⅱ级)组织中mRNA表达水平明显高于低分化胶质瘤(Ⅲ级和Ⅳ级)组织,其表达强度与肿瘤分化程度呈显著正相关。提示PIG11基因突变或缺失可能在胶质瘤的发生发展中起重要作用。PIG11蛋白为胞浆蛋白,其过表达可抑制胶质瘤细胞的增殖,诱导胶质瘤细胞的凋亡。PIG11基因有可能成为胶质瘤基因治疗的靶基因。
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