第一部分:可溶性血管内皮生长因子受体sFlt-1在老年小鼠下肢缺血性血管再生中的作用及其机制随着社会的发展,生活水平日益提高,老龄化程度不断加深,老年性下肢缺血性疾病的发病率也逐年上升。研究表明老化可削弱哺乳动物体内血管再生能力,从而导致组织再生能力的下降。在各种不同的哺乳动物中,与年龄相关的特征是血管生长因子失活及血管再生能力下降,表现为为血管内皮功能障碍和骨髓(Bone-Marrow,BM)及外周血内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)的数量减少和内在功能减退,血管内皮细胞凋亡与增殖的失衡,细胞外微环境变化(生长因子缺乏、炎症因子和氧化应激增高等)等。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)于 1989 年首次发现,是一种能特异的作用于血管内皮细胞的生长因子,具有促血管生成等活性的因子。VEGF家族成员包括胎盘生长因子(PIGF)、VEGFA-F及其受体VEGFR1-3及Neuropilins,其中VEGF受体特异性地分布于血管内皮细胞等,VEGF通过与其受体的结合而发挥促进血管新生和增强血管通透性的生理作用。VEGFR-1不仅在内皮细胞中表达,在造血干细胞、造骨细胞、胎盘滋养层细胞以及单核-巨噬细胞中也有表达。VEGFR-1与VEGF A-B-和PIGF有高度亲和力。人体和动物的研究已被证实体内生成的可溶性VEGFR-1(sFlt-1)由VEGFR-1的细胞外部分构成,发挥抑制VEGF的作用,VEGFR-1在血管新生期及缺氧时表达上调。另有研究表明妊娠妇女伴有先兆子痫患者的血清中sFlt-1的水平升高,而PIGF和VEGF的水平反而降低。众所周知,生物缺氧/缺血导致促血管生长因子的增加,如VEGF表达增加及其受体激活(包括Flt1和Flk1),诱导各种血管细胞的活动(包括诱导血管细胞增殖、迁移、侵袭)增加,从已有的血管中生成新的小管样结构,使血管管腔进一步成熟。越来越多的研究表明,在各种病理条件下血管VEGF及其VEGFR剪接可引起抗血管再生作用。可溶性血管内皮生长因子受体1(SolubleVEGFR1,sFlt1)被称为血管VEGF的拮抗剂,是一种缺乏细胞质和跨膜结构域的VEGFR剪接变体。最近的实验和临床研究得出了许多重要的结果,细胞培养中sFlt1通过结合并占据VEGFR从干扰VEGF占据和随之增长的信号转导。临床研究发现,在代谢紊乱和冠心病患者中血浆sFlt1水平的改变与其疾病的治疗与血管再生相关。最近的血管生物学研究表明,在人和动物的下肢缺血性疾病中,Wnt5/SC35的激活抑制血管再生,此外在骨髓细胞中,非正规的Wnt-sFlt1信号通路对血管再生起负性调控作用。老年下肢缺血性血管再生能力的减退是复杂的慢性的病理生理过程,然而其分子机制尚未完全阐明。目的:探讨老年小鼠的血管再生能力下降的分子机制,为临床治疗老年下肢缺血性疾病的新靶点提供实验依据。方法:建立下肢缺血小鼠模型,利用超声多普勒检测小鼠下肢血流,采用免疫组化观察缺血组织中巨噬细胞、粒细胞的表达和毛细血管密度,采用免疫印迹法、PCR和ELISA方法检测血液中sFlt1水平、观察Wnt/SC35表达及VEGFR2/Akt信号通路蛋白表达水平;采用双重免疫荧光法观察分泌VEGF和sFlt1的细胞;明胶酶谱法观察MMP-2/-9活性;利用流式细胞术观察衰老对骨髓源EPC水平;利用siRNA-Wnt5转染法观察Wnt5a蛋白的表达;培养HUVECs细胞后利用Diff-Quik染色,用BZ-Ⅱ分析仪计算细胞数量,使用CellTiter 96AO试剂盒测定细胞迁移、侵袭和增殖率;采用5β-半乳糖苷酶(βGal)染色法观察HUVECs衰老表型。结果1.老化对缺血性血管再生的影响与年轻小鼠相比,老年小鼠缺血/非缺血血流量比值的恢复持续受阻,非缺血和缺血骨骼肌均毛细血管密度减低。2.老化对sFlt1表达及下游信号传导通路的影响与年轻小鼠相比,老年小鼠缺血骨骼肌中总sFlt1基因水平显著增加,sFlt1阳性染色信号(即剪接变体的sFlt1(77kDa)和sFlt114(82kDa))表达明显增加,Flt-1主要表达于浸润到巨噬细胞,p-VEGFR2和p-Akt蛋白表达降低。3.老化对Wnt5a/11和SC35表达的影响与年轻小鼠相比,在老龄小鼠缺血性骨骼肌中Wnt5a、Wnt5amRNA及SC35蛋白表达均增高,并且Wnt11基因水平也增高,而其他Wnt家族成员(Wnt3和3a、Wnt5b,WNT7a 和 7b、Wnt8a,Wnt9b,Wnt1Oa 和 10b),表达无显著差异。4.老化促进缺血骨骼肌炎症反应与年轻小鼠相比,老年小鼠缺血肌肉中Galectin-3蛋白及和TLR2蛋白表达水平增加,白细胞和巨噬细胞数量增加,MMP-2和MMP-9的Gelatinolytic活性水平显著增高。5.老化损害祖细胞的内在功能与年轻的老鼠相比,老年小鼠外周血c-Kit +/CD31 +祖细胞数量显著减少。老化明显减弱VEGF-A诱导的c-Kit+的迁移、侵袭和增殖率。6.老年小鼠骨髄源性CD11b +细胞分泌sFlt1未加热老化的骨髓源性CD1 1b+细胞(ACD11b+Cs)培养上清液(ACD1 1b+CM)抑制HUVEC的增殖,而未加热年轻的CD11b+细胞(YCD11b+Cs)培养上清液(YCD11b+CM)刺激HUVEC的增殖;YCD11b+CM增强VEGF-A诱导的细胞增殖,而在ACD11b+CM中无增殖效果;与YCD11b+Cs相比,缺氧刺激骨髓ACD11b+Cs的sFlt1蛋白合成分泌,而缺氧对年轻骨髓c-Kit+细胞(Yc-Kit+Cs)和老年骨髓c-Kit+细胞(Ac-Kit+Cs)的sFlt1蛋白合成无影响;YCD1 1b+CM刺激VEGF诱导的HUVEC形成小管腔结构,而ACD11b+CM则抑制形成小管腔结构。7.Wnt5a/SC35调控sFlt1释放及其下游VEGFR2/Akt信号通路Wnt5a不仅抑制其本身mRNA合成,而且抑制其下游SC35蛋白表达及缺氧诱导的 sFlt1 释放;与 siCont-浓缩 ACD11b+CM 相比,siWnt5a-浓缩 ACD11b+CM明显促进 VEGF 诱导 HUVECs 的 VEGFR2 和 Akt 磷酸化;siWnt5a-ACD1 1b+CM明显改善VEGF诱导的HUVEC形成小管样结构;与不加热ACD11b+CM相比,加热siWnt5aACD11b+CM抑制VEGF诱导的年轻EPC-样c-Kit+细胞增殖,具有EPC小管样结构的刺激作用。结论1.老化可引起抑制血管再生能力。2.sFlt1的表达水平增高可能是引起VEGFR2/Akt通路失活的原因,在降低老年动物缺血诱导的血管再生中发挥决定性作用。3.Wnt5a/SC35表达水平与老化有密切相关,表明老化可诱发缺血性缺血时过度的炎症反应。4.骨髓CD11b+巨噬细胞可能是在缺血缺氧的应激条件下sFlt1表达的主要细胞来源,抑制老年小鼠的抗血管生成能力。5.Wnt5a/SC35调控老化缺血骨骼肌中巨噬细胞合成及分泌sFlt1,通过减弱VEGFR2/Akt信号通路,抑制老年小鼠的血管再生能力。老化抑制缺血性血管再生的机制可能是在缺血缺氧应激条件下激活巨噬细胞Wnt5a/SC35轴依赖的sFlt1合成及分泌,从而降低ECs和EPCs中VEGFR2/Akt信号通路的失活而导致老化缺血性血管再生能力减退。第二部分:心力衰竭患者血清中组织蛋白酶K浓度的临床意义半胱氨酰组织蛋白酶(Cysteinyl cathepsins)是半胱氨酸的木瓜蛋白酶家族成员之一,是蛋白酶超级家族。在人类中,已经识别确定了 11种该家族成员,即cathepsinsB,C,F,H,K,L,O,V,W,和X。所有成员共享一个守恒:即与半胱氨酸、组氨酸和门冬氨酸残留物形成活跃的三维立体的囊状结构。组织蛋白酶的一级结构包括信号肽,前导肽,重链及轻链。正常情况下,组织蛋白酶在核糖体以带有N端信号肽的前体形式存在,在信号肽的引导下,定位到高尔基体,甘露糖残基被修饰为6-磷酸甘露糖(mannose-6 reside phosphorylation,M6P)。修饰后,通过6-磷酸甘露糖受体依赖性或非依赖性通路转移至内质网和溶酶体,逐步被多种蛋白水解酶(如胃蛋白酶、嗜中性弹性蛋白酶、组织蛋白酶D)激活或自身激活,并以钙离子依赖的"胞吐"(exocytosis)方式分泌到细胞外,参与溶酶体蛋白质的重新利用。近年来的研究发现,组织蛋白酶在细胞内和细胞外的血管生成和心血管疾病中扮演着非传统的角色。不仅如此,最近专家们研究还发现,组织蛋白酶在溶酶体以外的细胞内和细胞外参与信号传递和调控细胞功能,并在血管生成及心血管重构过程中扮演着非传统的角色。组织蛋白酶K(CathepsinK,CatK)是木瓜蛋白酶家族的一员,初期发现在巨噬细胞和破骨细胞分泌,随后发现在血管动脉硬化病变部位血管平滑肌细胞及炎症细胞的高表达等。除能降解胶原蛋白外,还能降解弹力蛋白及纤维蛋白,并在骨质重塑以及血管再生和动脉硬化形成及发展中起极其重要作用。已有研究证明在衰竭的心脏中,组织蛋白酶的表达发生变化,提示组织蛋白酶参与这一病理变化。Hua等研究中发现高脂饮食相关受损心肌细胞收缩功能和细胞内Ca2+处理,是通过组织蛋白酶K基因敲除来调节。此外,组织蛋白酶K抑制,可以使棕榈酸诱导的受损的心肌收缩力恢复,这表明组织蛋白酶K直接调节心肌收缩力。研究者们一直认为上调肌浆网钙泵(SERCA2a)的表达,可以降低心脏肥大。而Hua等发现了高脂喂养之后SERCA2a和phospholamban(受磷蛋白)表达上调,更重要的是组织蛋白酶K敲除之后导致受磷蛋白与SERCA2a表达比例提高,尽管这些变化的机制目前尚不明确。在组织蛋白酶K敲除的小鼠心肌细胞中静息Ca2+浓度增加和SERCA2a的表达上调,可以部分地解释组织蛋白酶K敲除所致心肌收缩力提高的机制。2013年,作者们在研究中有个突出的发现,老鼠缺乏组织蛋白酶K基因有抵抗压力负荷诱发的心脏肥厚、纤维化及收缩异常的现象,在分子水平上组织蛋白酶K敲除减缓压力负荷诱发的心脏肥厚。在心肌细胞,压力超负荷抑制了心肌细胞收缩功能,随同降低了静息的Ca2+水平和延迟了Ca2+的清除,中断了细胞内钙离子动态平衡,其中调解效果是通过组织蛋白酶K的敲除来完成。组织蛋白酶K敲除未能改变压力超负荷之后的小鼠的血压,提示组织蛋白酶K敲除后的收益为心脏特异性。研究中还发现上调组织蛋白酶K表达的小鼠左心室组织受到压力负荷之后,更快的出现心脏衰竭。由此可见,组织蛋白酶K在心脏肥厚中起着致病、促进心脏肥厚等作用。最近,本课题组在临床研究中发现了在心房纤颤和冠心病患者血浆中CatK增高,但尚无慢性心衰与血浆中的CatK的浓度相关性的研究。目的探讨慢性心衰患者血浆中Cat K浓度变化及其临床意义,试图找出CHF患者血液各项指标中有用的非侵入性生物标志物。方法选择为2012年3月至2014年3月就诊于延边大学附属医院的慢性心衰(CHF)失代偿患者共计134例,所有入选患者的标准均为心功能NYHA分级Ⅱ-Ⅳ级并伴有射血分数降低的CHF患者(包括有心肌梗死病史,原发性高血压或特发性扩张型心肌病的CHF患者)。CHF患者接受标准药物治疗包括:利尿剂,正性肌力药物(如地高辛),他汀类药物,β-受体阻滞剂,血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素I型受体拮抗剂(ARB),将全部患者以左室射血分数(LVEF)值不同分为低 EF 值组(EF<40%,n=44)和高 EF 值组(EF≥40%,n=90)。全部患者取静脉血液使用酶联免疫检测吸附试验(ELISA)检测血浆CatK浓度、N 末端脑钠肽(NT-proBNP)、肌钙蛋白、LDL、HDL、hs-CRP 和 HbAic水平采用SONOS2500的超声心动图诊断仪测定左室后壁厚度(LVPWT)、室间隔厚度(IVST)、左室舒张末期内径(LVDd),左心室收缩末期内径(LVSD)及左室射血分数(LVEF),使用M-型法测量左房内径(LAD)。结果1.两组患者的年龄和体重指数无显著性差异。2.线性回归结果分析表明血浆CatK水平与LVEF(r =-0.4,P<0.001)呈负相关,与LVDd(r = 0.2,P<0.01)和LVDs(r = 0.3,P<0.001)水平呈正相关,血浆CatK水平和LAD(r = 0.3,P<0.01)也呈正相关。3.134例患者中心功能Ⅱ级的患者17例、心功能Ⅲ级的患者47例、心功能IV级的患者70例。LVDd和LVDS的测定值分别为55.9±14.5mm和48.7±11.9 mm,提示左心室扩张。IVST和LVPWT的测定值分别为9.3 ± 1.5 mm和12.5±2.1 mm。LVEF 降低至 41.9±8.3%。血浆 BNP 及 CatK 浓度分别为 4024±4026 pg/ml和51.6±16.6 ng/ml。在低LVEF值组患者中脑血管疾病,或接受血管修复术的发病率更高,表明低LVEF值组患者更需要接受醛固酮受体拮抗剂、利尿剂和地高辛这些传统药物的综合治疗;两组IVST或LVPWT值无明显统计学差异。4.在单因素回归分析中年龄、性别、高血压、LVDd、LAD、和CatK水平与CHF显著相关。而体重指数,糖尿病,超敏C反应蛋白和肌钙蛋白I与CHF是无相关性。多元回归分析结果表明高血压(比值比[OR]4.11;95%可信区间[CI]1.08-15.69;P<0.05)、LAD(比值比[OR]1.13;95%CI 1.01-1.25;P<0.05)、左心室舒张末期内径(比值比[OR]1.20;95%CI,1.05-1.37;P<0.01)和CatK(比值比[OR]0.90;95%CI 0.84-0.95;P<0.01)水平均与 CHF 显著相关。结论1.血浆CatK水平升高可以作为CHF 一种新的生物标志物;2.血浆CatK浓度可作为对CHF患者的心肌重构与功能障碍程度的一种无创的监测指标。