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猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员,是圆环病毒属的代表种,分为PCV1和PCV2两个血清型。其中PCV2可引起多种疾病并严重导致猪群产生免疫抑制,从而容易继发和并发其他传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本实验室在诊断PCV2的过程中,从患PMWS猪血清中分离到2株类PCV2因子(暂定P1和P2)。其中的P1因子全长648个核苷酸,部分与PCV2具有高度的同源性。虽然现在对P1因子生物学特性的研究上有了许多进展,但对其在猪群中的流行情况尚不清楚。因此通过表达P1因子特异的pCap(partial Cap)蛋白建立间接ELISA对调查其在猪群中传播范围和临床诊断有重要意义。1.类猪圆环病毒因子P13pCap串联蛋白原核表达和优化软件分析表明,P1基因组的371位缺失了对应于PCV2反向互补序列461位的碱基A。本次实验研究的pCap基因是P1因子370位到495位的核苷酸序列。设计引物将含有不同酶切位点的三个重复序列经PCR扩增后,连接到pET-28a(+)载体中。将构建好的重组质粒pET-28a-3pCap转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达得到分子量为14.7kDa的融合蛋白。最佳诱导条件为：37℃条件下,摇菌至OD值为0.4-0.6后加入IPTG至终浓度为1.0mM,诱导8h后目的蛋白的表达量最高。Western blotting结果表明,诱导出的蛋白可以跟P1因子兔高免血清发生特异性反应。表明P1因子三个重复的pCap基因编码的串联蛋白原核表达成功。2.基于类猪圆环病毒因子P13pCap串联蛋白的间接ELISA的建立将3pCap串联蛋白包被酶标板进行间接ELISA实验,经条件优化,确立了最佳反应条件,最佳抗原包被浓度为2.62μg/mL;最佳血清稀释度为1：100；最佳包被时间为4℃过夜；最佳封闭条件为1%BSA37℃封闭1h；酶标二抗最佳稀释度为1：5000,最佳底物反应时间为4min。并对优化后的间接ELISA方法的敏感性、特异性、重复性和稳定性进行了测试。实验结果表明建立的间接ELISA方法与CSFV、PRV、FMDV、PRRSV、PPV、SS2、PCV2、MHP、HPS和PCP的阳性血清均无交叉反应；批间和批内变异系数分别为2.91%～7.61%和1.50%～3.98%；与间接免疫荧光相比较符合率为94.1%；已包被蛋白的酶标板在-20℃中可以保存11个月以上。结果表明,本次实验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为商品化的P1因子血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。3.江苏及周边四省市类猪圆环病毒因子P1流行病学调查通过建立的间接ELISA方法检测江苏、安徽、山东、浙江和上海五省市送检的于2008年～2011年之间采集的1135份猪血清。江苏检测的两个猪场(南京、淮安)共有血清156份,总阳性率为34.6%；安徽送检的三个猪场(淮南、合肥、滁州)共有血清212份,总阳性率为18.9%；山东送检的两个猪场(青岛、临沂)共有血清148份总阳性率为45.3%；上海送检的一个猪场血清90份,阳性率为14.4%。浙江送检的3个猪场(金华、湖州、杭州)共有血清529份,总阳性率为33.6%,其中杭州共送检血清405份,阳性率为38.5%,其中母猪、哺乳仔猪、保育猪、生长育成猪、种公猪阳性率分别为53.3%、48.6%、34.5%、18.3%、20%。