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START(StAR-related lipid-transfer)结构域广泛存在于生物体内。动物中START结构域多与磷腊转运有关,而植物中对START结构域家族成员的研究多集中在对含START结构域的多结构域基因功能的探究上。拟南芥中START结构域蛋白质家族成员共35个,其中有9个仅含START结构域(分别命名为PCST1、PCST2、PCST3、PCST4、PCST5、PCST6、PCST7、PCST8、PCST9)。生物信息学分析发现PCST7和PCST8与其他仅含START结构域家族成员亲缘关系较远,我们前期已对PCST1、PCST2、PCST3、PCST4、PCST5、PCST6的功能进行了分析,PCST7和PCST8是否与上述家族成员功能相似,或具有其他生物学功能?本研究对其进行功能分析,为明确START结构域的功能及作用机制提供理论基础。
生物信息学分析表明,PCST7基因全长1158bp,包含5个外显子和4个内含子,编码461个氨基酸,在第69-228氨基酸编码蛋白仅包含1个START保守结构域;PCST8基因全长2468bp,包含6个外显子和5个内含子,编码541个氨基酸,在第99-296氨基酸编码蛋白仅包含1个START保守结构域。
表达模式分析表明,在幼苗期,PCST7和PCST8均主要在根毛区、下胚轴和子叶中有大量表达;在成苗期,PCST7与PCST8的表达明显不同,在根、果荚、叶片中PCST7的表达量明显高于PCST8,在花和茎中PCST7和PCST8的表达量无明显差异,但PCST7主要集中在花瓣和花粉中,而PCST8主要在花萼中表达。亚细胞定位分析表明,PCST7蛋白主要定位于拟南芥细胞质膜上;PCST8蛋白定位在细胞质膜和细胞核上。说明PCST7和PCST8虽同源关系较近,但具有不同的时空表达特性。
通过对PCST7和PCST8的功能获得和缺失转基因植株的表型分析,发现PCST7和PCST8在拟南芥生长发育及极性建成过程中具有重要的调控功能。结果如下:
在调控拟南芥生长发育方面,PCST8过表达转基因植株幼苗与野生型相比个体变小,其T-DNA突变体与野生型相比个体变大,而PCST7的过表达和T-DNA突变体转基因植株幼苗个体大小无明显差异,表明PCST8负调控幼苗大小;PCST7和PCST8过表达转基因植株均表现为根长变短,分别短6mm和8mm,T-DNA插入突变体根长与野生型相比无明显变化;在生殖生长阶段,PCST7和PCST8过表达转基因植株均表现为花粉管的长度变长,而T-DNA突变体花粉管长度变短。对PCST7和PCST8过表达及T-DNA植株种子千粒重进行统计,发现PCST7过表达和以及PCST8过表达植株种子千粒重小于野生型,PCST7和PCST8T-DNA突变体种子千粒重与野生型无显著性差异。
在调控拟南芥极性建成方面,PCST7过表达植株呈严重不对称生长,T-DNA插入突变体可正常生长;PCST8过表达与T-DNA插入突变体植株均可正常生长。在生殖生长阶段,PCST7和PCST8各过表达株系花器官两对花瓣的形态发生变化,pcst7和pcst8株系花器官可正常生长;PCST7和PCST8各过表达株系对1nm微丝解聚剂Lat B(Latrunculin B)处理敏感,花粉管出现解聚扭曲现象,而PCST7和PCST8T-DNA突变体花粉管与野生型相似,花粉管能够较正常地进行延伸。
在对分子机制的探究上,验证了PCST7与SUMO1(Small ubiquitin-related modifierl),PCST8和CHIP(Carboxyl terminus of HSC70-interacting protein)有互作关系。
由于START结构域在甾醇或磷脂的运输和代谢中起作用,油菜素类固醇BRs(brassinosteroids)是一种类固醇激素,在植物生长发育方面起着重要作用[1],因此分析了PCST7和PCST8与BR信号传导途径的关键基因BRI1(Brassinosteroid-insensitive1)、BIN2(Brassinosteroid-insensitive2)、BES1(Bril-ems-suppressorl)、BZRi(Brassinazole-resistant1)、CPD(Constitutive photomorphogenic dwarf)的关系,发现PCST7和PCST8的过表达株系和T-DNA插入突变体BRI1与BIN2的表达量升高,BES1的表达量降低;PCST7过表达株系和T-DNA插入突变体中BZR1的表达量升高,而PCST8过表达株系和T-DNA插入突变体中BZR1的表达量下降;PCST7和PCST8的两个过表达株系和T-DNA插入突变体中CPD的表达量降低,而PCST7和PCST8的一个过表达株系中CPD表达量明显升高。
本研究还对仅含START结构域的亲缘关系较近的5个蛋白质(PCST1、PCST2、PCST4、PCST5、PCST6)进行了功能探究,发现这5个蛋白质与幼苗生长速率、花粉管的延伸以及极性生长有关。
综上所述,本论文明确了PCST7和PCST8的表达模式;明确了PCST7参与调控拟南芥幼苗极性生长,PCST8参与调控拟南芥个体大小,PCST7和PCST8参与调控花器官极性建成、花粉管伸长和极性延伸、种子重量;明确了PCST7与PCST8同泛素化过程相关蛋白SUMO1和CHIP的互作关系;分析了PCST7和PCST8对BR信号转导途径关键基因表达量的影响;并综合分析了仅含START结构域蛋白质亚家族对拟南芥生长发育的影响,对深入探究START结构域蛋白质功能具有重要意义。
生物信息学分析表明,PCST7基因全长1158bp,包含5个外显子和4个内含子,编码461个氨基酸,在第69-228氨基酸编码蛋白仅包含1个START保守结构域;PCST8基因全长2468bp,包含6个外显子和5个内含子,编码541个氨基酸,在第99-296氨基酸编码蛋白仅包含1个START保守结构域。
表达模式分析表明,在幼苗期,PCST7和PCST8均主要在根毛区、下胚轴和子叶中有大量表达;在成苗期,PCST7与PCST8的表达明显不同,在根、果荚、叶片中PCST7的表达量明显高于PCST8,在花和茎中PCST7和PCST8的表达量无明显差异,但PCST7主要集中在花瓣和花粉中,而PCST8主要在花萼中表达。亚细胞定位分析表明,PCST7蛋白主要定位于拟南芥细胞质膜上;PCST8蛋白定位在细胞质膜和细胞核上。说明PCST7和PCST8虽同源关系较近,但具有不同的时空表达特性。
通过对PCST7和PCST8的功能获得和缺失转基因植株的表型分析,发现PCST7和PCST8在拟南芥生长发育及极性建成过程中具有重要的调控功能。结果如下:
在调控拟南芥生长发育方面,PCST8过表达转基因植株幼苗与野生型相比个体变小,其T-DNA突变体与野生型相比个体变大,而PCST7的过表达和T-DNA突变体转基因植株幼苗个体大小无明显差异,表明PCST8负调控幼苗大小;PCST7和PCST8过表达转基因植株均表现为根长变短,分别短6mm和8mm,T-DNA插入突变体根长与野生型相比无明显变化;在生殖生长阶段,PCST7和PCST8过表达转基因植株均表现为花粉管的长度变长,而T-DNA突变体花粉管长度变短。对PCST7和PCST8过表达及T-DNA植株种子千粒重进行统计,发现PCST7过表达和以及PCST8过表达植株种子千粒重小于野生型,PCST7和PCST8T-DNA突变体种子千粒重与野生型无显著性差异。
在调控拟南芥极性建成方面,PCST7过表达植株呈严重不对称生长,T-DNA插入突变体可正常生长;PCST8过表达与T-DNA插入突变体植株均可正常生长。在生殖生长阶段,PCST7和PCST8各过表达株系花器官两对花瓣的形态发生变化,pcst7和pcst8株系花器官可正常生长;PCST7和PCST8各过表达株系对1nm微丝解聚剂Lat B(Latrunculin B)处理敏感,花粉管出现解聚扭曲现象,而PCST7和PCST8T-DNA突变体花粉管与野生型相似,花粉管能够较正常地进行延伸。
在对分子机制的探究上,验证了PCST7与SUMO1(Small ubiquitin-related modifierl),PCST8和CHIP(Carboxyl terminus of HSC70-interacting protein)有互作关系。
由于START结构域在甾醇或磷脂的运输和代谢中起作用,油菜素类固醇BRs(brassinosteroids)是一种类固醇激素,在植物生长发育方面起着重要作用[1],因此分析了PCST7和PCST8与BR信号传导途径的关键基因BRI1(Brassinosteroid-insensitive1)、BIN2(Brassinosteroid-insensitive2)、BES1(Bril-ems-suppressorl)、BZRi(Brassinazole-resistant1)、CPD(Constitutive photomorphogenic dwarf)的关系,发现PCST7和PCST8的过表达株系和T-DNA插入突变体BRI1与BIN2的表达量升高,BES1的表达量降低;PCST7过表达株系和T-DNA插入突变体中BZR1的表达量升高,而PCST8过表达株系和T-DNA插入突变体中BZR1的表达量下降;PCST7和PCST8的两个过表达株系和T-DNA插入突变体中CPD的表达量降低,而PCST7和PCST8的一个过表达株系中CPD表达量明显升高。
本研究还对仅含START结构域的亲缘关系较近的5个蛋白质(PCST1、PCST2、PCST4、PCST5、PCST6)进行了功能探究,发现这5个蛋白质与幼苗生长速率、花粉管的延伸以及极性生长有关。
综上所述,本论文明确了PCST7和PCST8的表达模式;明确了PCST7参与调控拟南芥幼苗极性生长,PCST8参与调控拟南芥个体大小,PCST7和PCST8参与调控花器官极性建成、花粉管伸长和极性延伸、种子重量;明确了PCST7与PCST8同泛素化过程相关蛋白SUMO1和CHIP的互作关系;分析了PCST7和PCST8对BR信号转导途径关键基因表达量的影响;并综合分析了仅含START结构域蛋白质亚家族对拟南芥生长发育的影响,对深入探究START结构域蛋白质功能具有重要意义。