【摘 要】
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蓝刺头多糖B（ETPB）是从中草药蓝刺头中提取的一种多糖组分,前期研究证实该组分可以改善高脂饮食下2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）大鼠肝脏胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）,但作用机制尚不明确。本研究通过给予体外构建的肝源细胞HepG2胰岛素抵抗模型（IR-HepG2）ETPB,探讨其是否具有改善高脂诱导的IR-HepG2细胞的IR作用
【基金项目】
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“蓝刺头对实验性Ⅱ型糖尿病大鼠降血糖作用机制的研究”（31460674）,国家自然基金资助；
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蓝刺头多糖B（ETPB）是从中草药蓝刺头中提取的一种多糖组分,前期研究证实该组分可以改善高脂饮食下2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）大鼠肝脏胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）,但作用机制尚不明确。本研究通过给予体外构建的肝源细胞HepG2胰岛素抵抗模型（IR-HepG2）ETPB,探讨其是否具有改善高脂诱导的IR-HepG2细胞的IR作用。方法:（1）以人源性肝细胞株HepG2为研究对象,MTT法筛选ETPB干预HepG2细胞的安全浓度。0.25mM棕榈酸（PA）诱导24h构建IR-HepG2细胞。评估ETPB对IR-HepG2细胞糖脂代谢紊乱的改善作用。（2）使用Illumina Hi Seq 2500平台进行测序,筛选差异表达miRNAs（DEMs）和m RNAs（DEGs）,条件为fold change>1.5且p-value<0.05。对DEMs和DEGs进行生物信息学分析,对DEGs和DEMs进行qPCR验证,构建miRNA-mRNA调控网络。（3）利用细胞转染,qPCR和Western blot验证筛选出的miR-494-3p对FOXO1/PGC1α信号通路的调控作用。（4）利用细胞转染,qPCR和Western blot验证ETPB对miR-494-3p/FOXO1/PGC1α信号通路的调节作用。（5）高效凝胶渗透色谱（HPGPC）法测定ETPB的分子量;高效液相色谱（HPLC）PMP柱前衍生法对ETPB的单糖组成进行分析。结果:（1）MTT法得到3mg/mL ETPB为HepG2细胞的最大安全剂量。0.25mM PA作用HepG2细胞24h后成功构建了IR-HepG2细胞模型。与模型组相比,1mg/mL ETPB作用24h后显著上调了IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量和糖原合成量（p<0.05,p<0.01）。与正常对照组相比,模型组细胞的FFAs和TG的含量显著增加（p<0.01）;1mg/mL ETPB在作用18h时显著抑制了IR-HepG2细胞FFAs和TG的合成（p<0.01）;油红O染色后,正常HepG2细胞仅有少量细小脂滴,模型组细胞内则有大量脂滴,表明在经PA处理后HepG2细胞发生了脂肪变性,经3mg/mL ETPB处理24h IR-HepG2细胞内脂滴沉积量发生了减少。（2）对正常组（NC）、模型组（MC）、1mg/mL ETPB处理12h（ETPB1）和24h（ETPB2）组进行测序和生物信息学分析。确定了组间比较中的DEGs和DEMs。选取8个DEGs和5个DEMs进行qPCR检测。对DEGs进行Short Time-series Expression Miner（STEM）分析,筛选6个profiles内的基因进行GO和KEGG富集分析,构建胰岛素抵抗信号通路中DEGs和与其有靶向关系的DEMs的调控网络。（3）在HepG2细胞中,miR-494-3p靶向调控FOXO1,进而调控PGC1α、PCK2和G6PC等分子抑制IR-HepG2的糖异生作用。（4）ETPB通过调控miR-494-3p/FOXO1/PGC1α抑制了IR-HepG2的糖异生。（5）ETPB是由摩尔比为0.406∶0.19∶0.145∶0.137∶0.058∶0.027∶0.021∶0.01∶0.006的葡萄糖（Glc）、半乳糖醛酸（GlaUA）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖胺（GlcN）和葡萄糖醛酸（GlcUA）组成的,且分子量为9KDa成分均一的杂多糖。结论:（1）ETPB对PA诱导的IR-HepG2细胞的糖脂代谢有改善作用。（2）（2）ETPB改善HepG2细胞IR的调节机制可能是通过调控miR-494-3p/FOXO1/PGC1α信号通路从而抑制IR-HepG2的糖异生作用实现的。（3）ETPB是一种分子量为9KDa成分均一的杂多糖。
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