原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)绝大多数是肝细胞癌(HCC),素有“癌中之王”之称,现有的治疗手段效果均不佳,因此越来越多的学者致力于肝细胞癌基因靶向治疗的研究。肝细胞癌的发生是多因素、多途径、多步骤长期作用的结果,包括外环境致癌因素(病毒、寄生虫、细菌的感染、黄曲霉毒素的摄入、水源污染以及吸烟、饮酒)和自身遗传因素(癌基因的激活和抑癌基因的失活)。目前已经发现与人类肝细胞癌的发生有关的基因有:N-ras、c- fos、p53、C- myc、IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR、p16、p21、DCC、nm- 23、c- erB-b- 2、TGF-α、CSF- IR、raf等。癌基因和抑癌基因的突变是肝细胞癌发生的分子基础,肝细胞的癌变是一个多基因参与多阶段的过程。丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)系丝/苏氨酸激酶亚家族STE20中的一员,位于染色体2q11.2,含有33个外显子,编码区包括九个可供选择的剪接位点。人MAP4K4最早克隆于巨噬细胞cDNA库,不同来源的组织可分离出不同的由cDNA编码的MAP4K4亚型。MAP4K4属于丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路的一个上游激活因子,MAPK是一组可以被多种细胞外信号(包括生长因子,激素,紫外线辐射,DNA损伤剂,炎性细胞因子和环境应激等)激活的丝/苏氨酸激酶。MAPK信号转导通路非常保守,自膜受体到MAPK激酶激酶(MAPKKK)再到MAPK激酶(MAPKK)然后到MAPK,在细胞信号转导通路中MAPK处于细胞质部分的终末位置,活化后可以转到核内作用靶点,调节基因的表达。这种激活模型存在于酵母至哺乳类动物。它参与细胞的多种生物学行为,包括细胞凋亡,分化和增殖、细胞周期调控,细胞生存的维持以及细胞恶性转化等。STE20家族是MAPKKK的上游激酶,哺乳类动物STE20/丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶(MAP4K)家族由其催化区相关的28种丝氨酸/苏氨酸激酶组成。这些激酶可分为两种结构类别,P21活性蛋白激酶(PAKs)和生发中心激酶(GCKs)。GCK激酶缺乏PAKs激酶中调节Cdc42/Rac的作用区,而代之以N-末端激酶区和不同长度的C-末端延伸。C-末端是一个枸椽同源区(CNH),称为枸椽rho相互作用激酶(CRIK),该区域对于激酶活性的调节起着重要作用。GCK激酶在激酶区域外显示出低度同源性,并分为九个亚家族。MAP4K4是GCK IV组中的一个成员,它对细胞的作用包括调节细胞的运动性,细胞骨架重排以及细胞增殖等。研究发现MAP4K4在多种肿瘤中有高表达并证明了它在加速肿瘤细胞转化,促进细胞侵袭,降低细胞黏附性方面起着一定的作用。近期又有研究提出MAP4K4与卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤的侵袭和转移有着密切的关系,通过siRNA敲减这些细胞系的MAP4K4基因可抑制它们的侵袭和转移。最新研究报道MAP4K4在胰腺癌中也有高表达,并与其不良预后有关。以上提示MAP4K4信号通路很可能与肿瘤的发生,发展有着密切的关系。而目前对于MAP4K4在肝细胞癌中的研究尚未见报道。我国为肝细胞癌高发国家,大多数肝细胞癌的发生与乙肝病毒感染密切相关,HBV是我国肝细胞癌发生的最直接危险因素。本实验首先应用cDNA芯片对1例HBV相关肝细胞癌进行检测,发现MAP4K4基因在肝细胞癌组织较癌旁组织显著高表达,受此启发,本课题拟探讨MAP4K4在肝细胞癌的生物学活性中是否也发挥一定的作用。据此,本课题的研究思路为:首先,继续采用cDNA芯片技术对5例HBV相关肝细胞癌基因表达谱进行初步研究,对比癌和癌旁组织的差异基因表达,明确MAP4K4基因在肝细胞癌组织中确实较癌旁组织显著高表达。然后,采用分子生物学方法和组织芯片技术进一步从转录和翻译水平检测肝癌细胞株及肝细胞癌组织中MAP4K4的表达情况,验证基因芯片的结果,并分析不同临床病理参数中MAP4K4蛋白表达水平的差异,以初步证实MAP4K4在肝细胞癌发展中的临床意义。最后,再通过RNAi技术研究MAP4K4基因敲减对肝癌细胞生物学活性的影响,并通过基因芯片技术初步探讨其生物学作用产生的可能机制。第一部分肝细胞癌基因表达谱的初步研究目的:应用含20228个基因的人cDNA芯片研究5例HBV相关肝细胞癌及配对癌旁肝组织的基因表达差异。方法:随机选择HBV相关肝细胞癌及其癌旁肝组织样本5例分别抽提标本的总RNA,反转录为cDNA与芯片进行杂交,对比差异表达的基因。结果:HBV相关肝细胞癌组织相对于癌旁组织明显上调表达基因有52个(>3倍),其中上调大于5倍的基因为ASPH,FACL4,LAPTM4B,PEX11B,MAP4K4,SQSTM1,CCT3,CPD,CKS1B,HMGA1,ENO1;明显下调表达的基因有37个,下调大于10倍的基因为CYP2E1,MT2A,MT1X,CPS1,EXTL1,FCN3,CYP2A7,NOLA2,CYP3A4,CYP2B6,CYP4A11,HSD11B1。结论:通过cDNA芯片技术,发现肝细胞癌广泛存在的异常表达基因,其中MAP4K4基因明显上调,综合考虑它作为MAPK信号途径的一个上游因子可能参与了细胞分化、增殖、凋亡及恶性转化等生物学功能,因此进一步对MAP4K4基因进行分析将可能有助于了解它在肝细胞癌中的生物学作用,为肝细胞癌的基因靶向治疗开辟一条新途径。第二部分MAP4K4在肝癌细胞株及肝细胞癌组织中的表达目的:从转录和翻译水平检测肝癌细胞株及肝细胞癌组织中MAP4K4的表达情况,以验证基因芯片结果,并分析不同临床病理参数中MAP4K4蛋白表达水平的差异,初步证实MAP4K4在肝细胞癌发展中的临床意义。方法:选取20例新鲜肝细胞癌组织和配对癌旁肝组织标本及四种肝癌细胞(Hep3B,HepG2,SMMC7721,Huh-7)进行RT-PCR,qRT-PCR和Western-blot分别检测MAP4K4 mRNA和蛋白水平的表达;对400例肝细胞癌蜡块标本构建肝细胞癌组织芯片,采用免疫组织化学技术检测MAP4K4蛋白在含400例配对肝细胞癌及癌旁组织的表达活性,分析不同临床病理参数中MAP4K4蛋白表达水平的差异。结果:1.肝细胞癌组织中MAP4K4 mRNA的表达在癌旁肝组织,MAP4K4 mRNA表达为0.001339～0.018747(平均0.007900),而大部分癌组织表达高水平MAP4K4 mRNA,0.007367～0.080935(平均0.029500);与配对癌旁肝组织相比,肝细胞癌组织MAP4K4 mRNA上调1.062～28.520倍(平均6.852倍)。配对t-检验证实肝细胞癌组织和癌旁肝组织差异有显著性(P < 0.001)。2.肝癌细胞株中MAP4K4 mRNA的表达经RT-PCR检测,MAP4K4 mRNA在各细胞株的表达为:HepG2> Hep3B> Huh-7 > SMMC7721;qRT-PCR检测MAP4K4 mRNA在HepG2、Hep3B、Huh-7、SMMC7721四种肝癌细胞株中相对表达量依次为(0.016008±0.002358)、(0.015629±0.001389)、(0.011674±0.001456)、(0.004895±0.000947),结果得到qRT-PCR检测证实。3.肝癌细胞株MAP4K4蛋白表达经Western-blot检测,MAP4K4蛋白在四种肝癌细胞株中均有表达,在HepG2细胞中表达最高,其次是Hep3B细胞,而在SMMC7721中表达最低。4.MAP4K4在肝细胞癌组织中的定位和表达在正常肝、肝炎和肝硬化组织的肝细胞MAP4K4呈一致阴性或弱阳性表达,周围结缔组织、血管和胆管无MAP4K4阳性着色,Kuffer细胞和淋巴细胞生发中心可见阳性染色,与相应的癌旁肝组织相比,异型增生结节的肝细胞MAP4K4的表达明显强于正常肝、肝炎和肝硬化组织的肝细胞。肝细胞癌组织MAP4K4表达显著增强。肝细胞癌组织MAP4K4呈异质性表达,其中过度表达194例(48.5%),灶性阳性或阴性206例(51.5 %)。HBsAg阳性患者MAP4K4阳性率51.5%(157/305)显著高于阴性的38.8% (37/95)(P = 0.033);肿瘤直径≤2cm的MAP4K4阳性率31.6%(18/57)显著低于肿瘤直径> 2cm的51.3%(176/343) (P = 0.006);MAP4K4在不同组织学分级中的阳性率差异有显著性(P<0.001);肝内转移病例的MAP4K4阳性率55.5%(152/274)显著高于未转移者的33.3%(42/126)(P = 0.002)。MAP4K4表达在患者年龄、血清甲胎蛋白浓度、肝硬化、包膜浸润方面差异无显著性。结论:MAP4K4在肝细胞癌中普遍高表达,并且其表达水平与HBV感染状态,肿瘤大小、组织学分级及转移情况可能有一定关系。第三部分MAP4K4对肝癌细胞生物学功能的影响目的:检测MAP4K4基因敲减后肝癌细胞生物学活性(细胞增殖、细胞克隆形成、细胞周期、细胞凋亡)的改变并初步探讨其作用机制。方法:检测HepG2、Hep3B、Huh7、SMMC-7721肝癌细胞株中MAP4K4蛋白表达,选择表达活性最强者进行siRNA实验。设计一个空载体质粒转染组及三对靶向MAP4K4的特异性siRNA核苷酸序列质粒转染组(0—HepG2-pGCSil-U6,1—pSilMAP4K4-1,2—pSilMAP4K4-2,3—pSilMAP4K4-3),用Lipofectamine 2000法分别转染到选取的肝癌细胞,qRT-PCR和Western-blot方法检测干扰效率,并对转染后肝癌细胞进行WST-8细胞增殖实验,平板克隆形成实验,PI染色法细胞周期检测,Annexin V法细胞凋亡检测,然后,选择TOLL样受体信号途径相关芯片对干扰效果最好转染组及空载体转染组细胞进行基因检测,以进一步探究MAP4K4基因在肝癌细胞中可能的作用机制。结果:依据Western-blot检测四种肝癌细胞株中MAP4K4蛋白表达情况,我们选择其中表达该蛋白最高的HepG2肝癌细胞株作为MAP4K4-siRNA的研究靶标。1.qRT-PCR和Western-blot检测干扰效率转染干扰片段1,2,3后与对照组相比,MAP4K4 mRNA抑制率分别为68.7%,25.9%和53.7%;MAP4K4蛋白的抑制率分别为:61.4%,27.8%和45.8%。2.细胞生长形态改变MAP4K4 RNA干扰后,对数生长期的转染组细胞数目减少,体积变大,贴壁性增强,较对照组比较,圆形M期细胞比例减少。3. WST-8细胞增殖实验结果pSilMAP4K4-1、pSilMAP4K4-3组,细胞增殖速度明显减慢( p<0.01),而转染pSilMAP4K4-2组与对照组相比差异无显著性(p>0.05)。4.平板克隆实验结果各转染组细胞克隆形成能力的检测结果:HepG2-pGCSil-U6 (56.83±8.51%)、pSilMAP4K4-1组(13.75±4.26%)、pSilMAP4K4-2组(50.71±7.47%)、pSilMAP4K4-3组(28.11±6.36%)。pSilMAP4K4-1和pSilMAP4K4-3组细胞的平板克隆形成率明显低于对照组(p<0.01),而pSilMAP4K4-2组与对照组间的差异无显著性(p>0.05)。5.细胞周期实验结果与对照组比较, pSilMAP4K4-1和pSilMAP4K4-3组均出现S期阻滞(p<0.01),M/G1期细胞比例减少(p<0.01),S、G2期细胞比例增多(P<0.05)。而pSilMAP4K4-2组与对照组相比差异无显著性(p>0.05)。6.细胞凋亡检测结果经无血清诱导,与对照组比较,pSilMAP4K4-1、pSilMAP4K4-3组的HepG2细胞凋亡比例增多(p<0.05),而pSilMAP4K4-2组与对照组比较差异无显著性(p>0.05)。7.基因芯片检测结果干扰前后肝癌细胞样本的基因芯片检测结果显示MAP4K4基因敲减后,有一定数目与其相关的基因的表达有明显改变(上调2倍以上或下调1/2以上),参照TOLL样信号传导途径通路图进行分析,我们发现MAP4K4基因在肝细胞癌中可能是通过NF-kB及JNK信号传导途径发挥作用的。结论:MAP4K4基因敲减可以阻滞细胞周期的进程,抑制肝癌细胞的恶性增殖,其机制可能是通过NF-kB信号传导途径、JNK信号传导途径发挥作用。