细胞对于生长因子的不正常反应会造成细胞的异常生长,这在人类癌症的发生和发展中起关键作用。HER2目前引起了广泛的关注,因为其高表达预示着乳腺癌,卵巢癌,胃癌和其它癌症等的预后不良。HER2通常被看成是一个孤儿受体,当受到表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)刺激时,HER2作为EGFR家族的一个成员,与EGFR家族的其它成员形成同源或异源二聚体,进而激活下游的细胞信号通路,影响细胞功能。HER2的C末端酪氨酸残基的磷酸化是由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)两种酶精确协同控制的。其中的蛋白酪氨酸磷酸酶在细胞信号通路中作为一个重要的角色,调控细胞的功能。在不同的刺激条件下,蛋白酪氨酸磷酸酶的调节影响了细胞生长和增殖,细胞周期,细胞骨架等细胞功能。最近的研究发现PTP-MEG2, PTPN12, PTPN13和PTPN18,这些蛋白酪氨酸磷酸酶在特定的细胞环境中参与HER2相关的信号通路；然而,由这些磷酸酶调控HER2的酪氨酸磷酸化的机制从未详细探讨。其中,’PTPN18,也叫BDP1,是第一个被发现的针对HER2蛋白的酪氨酸磷酸酶；同时PTPN18的N端是蛋白酪氨酸磷酸酶催化结构区域,C端调控区域富集脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T),因此属于酪氨酸磷酸酶PEST家族。有趣的是,PTPN18只对HER2进行去磷酸化的作用,而不对EGFR或IGF1R的磷酸化的酪氨酸进行去磷酸化。以前的研究发现PTPN18可以调控HER2的磷酸化水平,然而这其中如何调控HER2信号通路的分子机制还不清楚。本论文研究表明PTPN18催化结构域水解底物具有严格的底物特异性,并且发现其C端调控结构域介导HER2泛素化的新功能。研究方法1)体外蛋白表达纯化通过大肠杆菌-BL21原核表达系统,表达带有GST和HIS标签的不同长度的PTPN18蛋白和部分蛋白酪氨酸磷酸酶家族的蛋白；通过亲和层析和离子交换的方法获得纯度高达95%以上的目的蛋白。2)体外酶活测定以小分子化合物pNPP和带有磷酸化的酪氨酸的短肽为底物,检测PTPN18的催化结构域对这两类底物的催化活力。利用点终止法通过酶标仪进行读数,获得酶活常数Kcat和Km。同时体外检测PTPN18催化结构域对细胞内生理底物-HER2的磷酸酶活力。3)晶体生长及晶体结构解析将纯化的PTPN18的催化结构域陷阱突变蛋白分别与含有HER2的pY1112, pY1196, pY1248这3个酪氨酸位点磷酸化的磷酸多肽混合,悬滴法共结晶,25℃静置3天后收集单晶,并通过X-射线衍射获得衍射数据,解析PTPN18的催化结构域蛋白与HER2磷酸短肽复合物的晶体结构。4)免疫共沉淀(CO-IP)技术在哺乳细胞HepG2细胞和MCF-7细胞中,过表达或干扰PTPN18以及β-TRCP后,通过免疫共沉淀的方法检测PTPN18与其它蛋白的相互作用以及PTPN18对HER2蛋白泛素化的影响。5) GST-pulldown实验将体外纯化的带GST标签的不同截短的PTPN18蛋白与细胞内HER2蛋白进行共孵育,检测不同截短的PTPN18蛋白对HER2蛋白的结合能力。6)MTT方法在HepG2细胞内过表达PTPN18不同的突变质粒或干扰PTPN18,通过加入MTT观察24-72小时的细胞增殖状态。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死的细胞没有这种功能。在酶联免疫检测仪(OD570nm)测定其光吸收值,间接反映活细胞的数量,从而反映PTPN18对细胞增殖的影响。7) Trans well方法在HepG2细胞内过表达PTPN18不同的突变质粒,加EGF刺激后,利用结晶紫染色,检测不同时间点内各个突变体对该细胞的侵袭的能力。8)免疫荧光染色在HepG2细胞内过表达PTPN18的野生型和D197A突变体,用单克隆抗体RPN12(蛋白酶体途径的标记物)和Lampl(溶酶体途径的标记物)检测PTPN18对HER2蛋白的分布、降解的调控作用。9) Western Blot在细胞系中对PTPN18进行干扰后,加EGF刺激检测在不同时间点HER2和EGFR的C末端不同的酪氨酸位点的磷酸化水平。在细胞系中过表达PTPN18野生型及不同的突变型,加EGF刺激后检测PTPN18对HER2的C末端不同的酪氨酸位点的磷酸化水平,以及对HER2相关信号通路(增殖,迁移和HER2蛋白降解)的影响。在细胞系中过表达HER2的C末端质粒,加EGF刺激后IP纯化HER2 C末端蛋白,与纯化的PTPN18的催化结构域蛋白进行体外酶活分析,利用Western检测PTPN18对HER2的C末端不同的酪氨酸位点的磷酸化水平。在细胞系过表达PTPN18野生型及不同的截短及失活突变后,检测PTPN18对HER2蛋白的结合能力。在多种乳腺癌细胞系或人乳腺癌组织样品中,检测PTPN18蛋白与HER2蛋白的表达量以及相关性。10)统计分析所有实验均重复3次以上,应用Image J分析软件对Western Blot进行蛋白定量分析；应用Graphad Prism5统计软件进行酶活数据的分析；所有数据均采用±标准误表示,采用单因素方差分析和t检验对相关数据进行统计分析,以P<0.01用**或##进行标记,以P<0.05用*或#进行标记。结果我们在蛋白分子水平和细胞水平研究并阐明了PTPN18的N端催化结构域和C端调控结构域对其底物HER2的调控作用。研究发现,PTPN18通过N端磷酸酶催化结构域对HER2的去磷酸化以及C端PEST结构域对HER2的泛素化进行精确调控,从而调控HER2介导的细胞内信号通路。具体结果如下：1)我们对PTPN18和HER2进行体外酶活性的测定和晶体结构的解析阐明了PTPN18对HER2的C末端不同的磷酸化位点具有选择性。我们解析了PTPN18催化结构域陷阱突变与磷酸多肽的复合物晶体结构(PTPN18与含有HER2的pY1112,pY1196,pY1248磷酸化位点的3个磷酸多肽的晶体复合物),并发现PTPN18中的催化区结构域对HER2的C末端的磷酸化的酪氨酸去磷酸化的选择特异性及结构基础。PTPN18与HER2的PY1112, pY1196, pY1248这3个磷酸多肽的晶体结构复合物同时显示了以下两种特殊的结构特征：(1)HER2短肽的pY+l位氨基酸残基与PTPN18具有疏水相互作用,可以选择性调节两者之间的作用。(2)PTPN18的第198位的精氨酸侧链的可塑性,其侧链对两种短肽底物的识别具有重要意义。2)我们研究发现PTPN18对HER2的不同磷酸化位点的特异性作用抑制了HER2介导的细胞增殖和细胞迁移。在细胞系中,过表达PTPN18野生型及不同突变型,发现PTPN18特异性去磷酸化HER2的C端第1196位和1248位酪氨酸的关键氨基酸(hot spot);阐明了PTPN18降低HER2的C末端的第1196位和第1248位的酪氨酸磷酸化水平,从而对HER2介导的细胞增殖和侵袭具有负向调控作用的分子机制。3)我们研究发现PTPN18的C端PEST调控结构域介导HER2泛素化的新功能。虽然PTPN18的催化结构域通过去磷酸化HER2的C末端第1112位酪氨酸的磷酸化,而减少与E3泛素连接酶c-Cbl的结合,从而延迟了HER2蛋白的溶酶体降解途径,但是PTPN18的PEST结构域可以促进泛素蛋白K48介导的HER2蛋白的泛素化进而引起蛋白酶体的降级途径。其中我们发现,PTPN18的C端第419-423位氨基酸序列中S419/S423磷酸化后与β-Trcp结合,通过"AKT-PTPN18/β-Trcp-HER2"泛素化途径对HER2蛋白有降快速解作用。PTPN18切换HER2的泛素化和降解的路线,这既需要PTPN18 N端的催化结构域和C端的PEST结构域。4)在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织样品中,我们发现PTPN18对HER2介导的信号通路具有负调控作用。PTPN18与HER2的蛋白表达水平比值与乳腺癌的分期负相关。本研究不仅探讨了PTPN18与HER2相互作用的详细的分子机制,而且发现了PTPN18的PEST结构域的新功能,对乳腺癌的诊疗具有深远意义。