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类固醇激素是以胆固醇为底物,在一系列类固醇合成酶的催化下合成的,在性别分化、性腺发育和内分泌稳态等多个方面起着举足轻重的作用。胆固醇需从细胞质基质转至线粒体内膜参与反应,该转运过程是类固醇激素合成的首个速控步,依赖于类固醇合成急性调节蛋白（Steroidogenic acute regulatory protein,StAR）。在哺乳类仅发现一个StAR基因,其作用在人类和小鼠模型中已有许多报道;在非哺乳脊椎动物中,均发现StAR基因的复制现象,人们将这两种StAR基因命名为StAR1与StAR2基因,然而对其在性腺发育、配子发生与类固醇生成等的作用机制却尚不清楚。本实验室前期已从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）性腺分离出两个StAR基因,发现StAR2基因从孵化后30 dah（days after hatching）的雄鱼精巢和5 dah的雌鱼卵巢中开始表达,并以其为实验动物,采用基因敲除技术（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）-associated enzyme Cas9,CRISPR/Cas9）敲除了StAR2基因并建系得到了纯合突变体。由我们之前的研究可知,StAR2-/-XY精巢早期减数分裂启动延迟,精子发生受阻,StAR2-/-XX卵巢早期雄性化。在此基础上,为更深入揭示StAR2在硬骨鱼类固醇合成与性别分化中的功用与机理,本研究开展了StAR2基因敲除对雄性罗非鱼精巢形态与发育、精巢类固醇合成和育性等影响及对雌鱼性腺发育和血清激素水平等影响的工作。本研究的实验结果如下:1.StAR2-/-XY的精巢形态与发育。通过H.E.（Hematoxylin-eosin）染色对120dah和300 dah的StAR2+/+XY和StAR2-/-XY精巢进行组织学观察。120 dah的StAR2-/-XY精巢虽有各级生精细胞,却未有输精管发育,暗示StAR2基因突变致输精管发育延迟。而300 dah的StAR2-/-XY精巢不仅充满各级生精细胞,且可见正常发育的输精管,但精小叶排列不规整,形态异常。2.StAR2-/-XY精巢类固醇生成受阻。在300 dah,经H.E.染色后,对精巢细胞计数的统计结果表明:与对照相比,StAR2-/-XY精巢Leydig细胞数极显著下降。免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）显示此时StAR2-/-XY精巢精小叶Leydig细胞标记基因阳性细胞排列异样,且Leydig细胞标记3β-HSD-I和Cyp17a1的信号明显减弱。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测显示,StAR2基因突变致使下游类固醇合成酶（cyp11a1、3β-HSD-I、3β-HSD-II、cyp17a1、cyp17a2和hsd17β3）基因表达显著降低。免疫印迹（Western blotting,WB）和光密度分析进一步显示,StAR2-/-XY精巢中3β-HSD-I和Cyp17a1的表达显著降低。酶联免疫反应（Enzyme-linked immunosorbent assay,EIA）实验发现:与对照相比,StAR2-/-XY血清雄激素水平显著下降。推断此时StAR2-/-XY可能因精巢Leydig细胞数的极显著降低,致表达类固醇合成酶基因的细胞数目亦极显著降低,随之影响类固醇激素合成。3.StAR2基因突变对雄鱼精巢胆固醇转运的影响。经油红O对成年雄鱼性腺染色,未见StAR2-/-XY精巢有大面积脂滴积聚的现象。Real-time PCR检测表明,与胆固醇转运有关的转位蛋白tspo（translocator protein）及电压依赖性阴离子通道2即vdac2（voltage dependent anion channel 2）基因在300 dah的StAR2+/+XY及StAR2-/-XY精巢的表达无显著差异。上述结果的产生可能因存在不通过类固醇转运的方式或存在其他胆固醇转运蛋白和脂肪酸结合蛋白。4.StAR2基因突变对雄鱼育性的影响。在300 dah,免疫组化和WB显示StAR2-/-XY与对照精巢均有大量Vasa阳性信号。Real-time PCR检测表明:与对照相比,敲除组精巢的生殖细胞标记基因（vasa）和减数分裂相关基因（sycp3和dazl）表达皆无显著差异。另外,StAR2-/-XY性腺外观无异常,性腺体重指数（Gonadal somatic index,GSI）正常。精子巴氏染色表明StAR2-/-XY的精子形态也正常。智能精子分析仪的检测显示,与对照相比,StAR2-/-XY的精子活力及直线速率（Straight line velocity,VSL）无显著变化。换言之,对300 dah的雄鱼而言,Real-time PCR和精子活力各项指标显示,StAR2-/-XY的精子发生已基本恢复正常,精子形态与活力亦未受影响。有趣的是,上文提到,300 dah的StAR2-/-XY的雄激素含量显著减少。随后检测到此时StAR2-/-XY的性腺雄激素受体ar（androgen receptors）和垂体促性腺激素gn（gonadotropins）基因表达上调。推测StAR2-/-XY虽雄激素水平下降,但ar和gn基因反馈上调,从而保证了此时正常的精子发生与精子活力。在540 dah,轻按对照组雄鱼腹部,可挤出大量精液。而StAR2-/-XY产精量急剧下降,不可挤出精液。组织学观察发现,StAR2-/-XY性腺与生殖突连接区段变细退化。H.E.染色显示此时StAR2-/-XY精巢形态异常,生精细胞排列紊乱。利用原位末端转移酶标记法（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）检测可知,与对照相比,StAR2-/-XY精巢生精细胞出现大面积强烈的绿色凋亡信号。总而言之,我们推测,540 dah的StAR2-/-XY性腺与生殖突连接区变细,致精液不能正常排出,生精细胞遂在精巢内大面积凋亡,最终育性受损或完全不育。5.StAR2基因突变影响雌鱼性腺发育及激素水平。我们在StAR2-/-XX中观察到几种不同表型:性逆转、不可产卵和可产卵。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）和分子标记琼脂糖凝胶电泳筛选出的部分StAR2-/-XX可产精液,其性腺已完全发育成精巢,与此同时,对上述StAR2-/-XX性腺H.E.染色,可观察到各级的生精细胞,相应地,IHC亦能染上特异表达于雄性的Cyp11b2（Cytochrome P450,family 11,subfamily B,polypeptide 2）阳性信号;而一部分StAR2-/-XX腹部胀满,生殖突似雄鱼,性腺血管明显,积绿色液体,仍是卵巢,含各级卵细胞,但卵无法排出,坏死于体内,因此GSI显著上升;然亦发现正常可排卵的StAR2-/-XX。进一步地,通过EIA实验测量了不同表型StAR2-/-XX及对照雌雄鱼的雄激素11-酮基睾酮（11-ketotestosterone,11-KT）及雌激素雌二醇（17β-estradiol,E2）。结果显示:StAR2-/-XX（不可产卵）的11-KT显著高于StAR2-/-XX（可产卵）且显著低于StAR2-/-XX（性逆转）;StAR2-/-XX（不可产卵）的E2显著高于StAR2-/-XX（性逆转）且显著低于StAR2-/-XX（可产卵）。简言之,即使StAR2-/-XX出现多种表型的分子机理还有待深入研究,但其表型差异也许和雌雄激素水平高低存在密切关联。综上所述,本论文在通过基因编辑技术构建StAR2纯合敲除系的基础上,研究了该基因突变对罗非鱼生殖发育和性别分化的影响。发现StAR2-/-XY性腺无脂质积聚,但精巢发育延迟,精小叶形态异常,精巢类固醇合成受阻,300 dah时可产精且有育性,然而后期精巢退化,凋亡信号极强烈,不可产精,不可育。而StAR2-/-XX出现三种不同表型,且差异表型可能与不同的雌雄激素水平有关。