近年来神经科学领域最重要的研究进展之一,为发现成年哺乳动物脑内某些特定区域存在进行性的神经发生,即存在新神经元的产生。这些新生神经元整合入现有神经系统环路,发挥功能性作用。研究发现,成年海马神经发生可受多种病理生理过程的影响。癫癎是一种常见的以反复神经元异常电发放为特征的神经系统慢性疾病。癫癎发作后,海马齿状回神经发生水平出现明显改变,这一现象为探讨癫癎后海马结构和功能可塑性的变化提供全新思路,也为癫癎的治疗带来新的曙光。但目前有关癫癎后神经前体细胞增殖、分化和新生神经元异常迁移及其调控机制等领域尚存许多空白,有必要针对性展开研究。本研究建立大、小鼠化学诱导癫癎模型,综合运用现代神经生物学研究手段,贯序性展开以下三部分研究内容:1.不同程度癫癎发作对海马新生神经元迁移作用的研究研究发现,癫癎发作可以增加海马齿状回神经发生的水平;且轻度及重度癫癎发作对海马NPCs增殖和分化的作用不同。但尚不知两者对齿状回新生神经元迁移的影响有何不同。本实验建立Li-PILO诱导的轻度癫癎发作和重度癫癎发作大鼠模型,运用免疫组织化学、免疫荧光双标、及BrdU标记等技术,系统观察不同程度癫癎发作后齿状回新生神经元迁移的情况;并对导致异常迁移可能的分子机制进行了初步探索。结果如下:⑴正常及轻度癫癎发作大鼠海马内,新生细胞迁移入颗粒细胞层,但严重癫癎发作后新生细胞迁移方向出现异常,多数迁移入齿状回门区。⑵严重癫癎发作后,新生神经元表现出异常迁移模式,形成异位门区基树突和门区异位神经元。⑶严重癫癎发作导致星形胶质细胞激活并表达nestin,而轻度癫癎发作后,海马中几无nestin阳性细胞。⑷严重癫癎发作导致齿状回门区内表达迁移诱向分子netrin 1和Sema-3A,而正常及轻度癫癎发作大鼠门区内未观察到这些分子的表达。以上结果提示,SE后齿状回门区内发育期神经诱向分子表达,这可能是门区异位神经元形成的原因。2.星形胶质细胞和小胶质细胞对癫癎后海马异常神经发生的研究建立Li-PILO诱导的SE模型,结合立体定位注射、免疫组化以及FJB染色等技术,观察癫癎后星形胶质细胞和小胶质细胞的时空激活特点;进而分别干预二者的激活水平,观察其对新生神经元异常迁移的影响。实验结果如下:⑴SE后3-20天,海马齿状回内星形胶质细胞和小胶质细胞均出现长程激活,并随时间推移表现出数量变化和形态差别。⑵通过向齿状回门区注射氟代柠檬酸(FC),抑制星形胶质细胞代谢,发现FC注射后不能阻断癫癎后异位门区基树突的形成,但加剧了癫癎后齿状回颗粒细胞的变性损伤。⑶通过给予米诺环素(MC)选择性抑制小胶质细胞激活,发现在SE 14天时,新生神经元向门区的异常迁移被有效抑制。⑷向正常齿状回门区内注射小胶质细胞激活剂LPS。注射后3天,齿状回内出现异位门区基树突的形成。上述结果提示,癫癎发作后齿状回门区内激活的小胶质细胞可能引导了新生神经元向门区的异常迁移,MC可能是一种潜在药物,阻止癫癎发作导致的新生神经元异常迁移。3.癫癎发生过程中海马内GABA能神经发生的研究癫癎发作可导致海马新生神经元异常迁移,参与癫癎发生过程,最终形成慢性癫癎。但癫癎发生过程中是否存在神经前体细胞(NPCs)向抑制性γ-氨基丁酸(GABA)能神经元分化,尚不明确。本研究利用特异性显示抑制性GABA能神经元的谷氨酸脱羧酶(GAD)67-绿色荧光蛋白(GFP)基因敲入小鼠,建立戊四氮(PTZ)慢性点燃模型和锂(Li)-匹罗卡品(PILO)诱导的癫癎状态(SE)模型,结合免疫组化、免疫荧光标记、BrdU标记等技术,观察两种癫癎模型中海马齿状回神经发生的情况,以及抑制性GABA能神经元的新生和存活。结果如下:⑴癫癎发作后早期阶段,两种癫癎模型均诱导海马齿状回新生细胞数量显著增加;PTZ点燃后2周和SE后8周,新生细胞数量均明显减少。⑵正常对照组中,约80%的新生细胞分化为神经元;而PTZ点燃组和SE组中,分别仅有58%和29%的新生细胞分化为神经元。⑶免疫荧光双标记、三标记结果显示,在正常对照组和癫癎组中,齿状回新生细胞均不能分化为GAD67阳性的GABA能神经元。⑷在SE模型,而非PTZ点燃模型中,海马齿状回内GABA能神经元总数显著减少。上述结果提示,不同类型癫癎发作对海马神经发生的影响不尽相同;而无论何种发作,齿状回内均未发现存在新GAD67阳性GABA能神经元的产生;但长期癫癎发作可导致齿状回GABA能神经元的丢失。