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鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectiouslaryngotracheitisvirus,ILTV）引起的以鸡呼吸困难、气喘、咳出带血粘液及产蛋下降为特征的重要传染病,给家禽生产带来较大经济损失。以新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）为载体构建基因工程重组疫苗是生产上预防ILT的重要方法之一,但传统NDV弱毒株存在不耐热、不利于保存运输等缺点,因此构建新型耐热NDV基因工程重组载体疫苗毒株具有重要意义。本实验室前期分离鉴定到一株耐热的NDV强毒株NDV/HR09,在此基础上构建了一株热稳定的新型嵌合病毒NDV/cHR-DT-CI,其F基因被替换为基因Ⅶ型毒株的F基因,并将F蛋白裂解位点序列突变为112ERQER↓L117（属于NDV Class I）。本研究以该NDV耐热弱毒株为母本病毒,利用反向遗传技术构建表达ILTV gB、gD和gI蛋白的3株重组疫苗候选株,并对其生物学特性进行鉴定,为ILT疫苗研发提供重要的技术基础。1.耐热新城疫病毒外源基因表达载体的构建本研究利用NDV/cHR-DT-CI反向遗传技术平台,在分析病毒全基因组序列的基础上,将Pme Ⅰ酶切位点引入NDV基因组P和M基因间的非编码区,构建含Pme Ⅰ酶切位点的NDV全基因组转录载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI;将构建的转录载体与3个辅助质粒（pCI-NP、pCI-P和pCI-L）共转染BSR细胞,进行病毒拯救及鉴定。结果显示,接种转染细胞及上清的SPF鸡胚尿囊液血凝结果为阳性,表明含PmeⅠ酶切位点的表达载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI构建成功。为验证载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI是否能够用于外源基因的表达,本研究将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Flurescent Protion,EGFP）基因通过无缝克隆技术重组到NDV表达载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI的Pme Ⅰ酶切位点,构建含EGFP基因和NDV全基因的转录载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-EGFP。经病毒拯救,在转染48h后,在荧光倒置显微镜下可以观察到绿色荧光,说明重组病毒构建成功,将获救的重组病毒命名为 NDV/rAHR09-Ⅶ-EGFP。为探究重组病毒的生物学特性,首先将重组病毒NDV/rAHR09-Ⅶ-EGFP在鸡胚上连续传20代,对不同代次重组病毒中的EGFP基因进行PCR扩增。结果显示,各代次重组病毒均能鉴定到EGFP基因,且测序结果正确,说明重组病毒具有较好的遗传稳定性;利用Western Blot方法对重组病毒中的EGFP进行鉴定,结果表明构建的重组病毒能够正常表达EGFP。然后,为探究外源基因的插入是否会影响重组病毒的耐热性能,将重组病毒置于 56℃分别处理 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 和 60 min,血凝结果显示耐热处理后重组病毒的血凝效价能够一直保持在8log2,证明重组病毒具有良好的热稳定性;最后,本研究对重组病毒对鸡胚的感染能力和毒力进行评价。结果显示该重组病毒对鸡胚的感染能力为108EID50/0.2mL,MDT值为148h,符合NDV弱毒株特征,证明外源EGFP基因的插入对NDV的毒力不产生影响。以上结果表明,本研究成功构建了一种含PmeⅠ插入位点的NDV表达载体,该载体能够成功表达外源基因。同时,外源基因的插入不影响重组病毒的耐热性和毒力。2.表达ILTV gB、gD和gI蛋白耐热重组新城疫病毒的构建以构建的表达载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI为基础,在Pme Ⅰ酶切位点处分别插入ILTV的gB、gD和gI基因,构建表达ILTV gB、gD和gI蛋白的耐热重组新城疫病毒。经病毒拯救,将成功获救的3株病毒命名为NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gB、NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gD 和 NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gI。以制作的 gB、gD 和 gI 蛋白多克隆抗体为一抗,对3株重组病毒外源蛋白表达进行Western Blot鉴定,结果显示3株重组病毒均能表达外源蛋白。为评价3株重组病毒的遗传稳定性,首先将3株重组病毒在SPF鸡胚上连续传20代,分别收集0代、5代、15代和20代的病毒尿囊液进行gB、gD和gI基因扩增鉴定,结果均能鉴定到对应的外源基因,且基因序列正确,表明外源基因均能在构建NDV重组病毒中稳定遗传。随后,对3株重组病毒进行耐热性的评价,选择HA效价相同的重组病毒于56℃分别处理10min、20min、30min、40min、50min和60min,结果发现3株重组病毒在处理60 min后HA效价仍不低于6log2,而相同处理条件下的LaSota株在56℃处理10 min后就失去了 HA活性,说明3株重组病毒均具有良好的耐热性。为评价3株重组病毒的毒力,首先在9～10日龄SPF鸡胚上测定3株病毒对SPF鸡胚的感染能力和毒力,测定结果表明3株重组病毒NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gB、NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gD 和 NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gI 的 EID50分别为 107.83EID50/0.2 mL、108.37EID50/0.2 mL 和 109.5EID50/0.2 mL,3 株重组病毒的 MDT 均大于 120 h,分别是148h、160h和159.5h;然后对3株重组病毒进行致病性测定,ICPI结果分别为0、0.2和0.1,均小于0.5,IVPI指数结果均小于0.8。以上结果表明3株重组病毒均符合NDV弱毒特征,可以作为ILT候选疫苗株用于免疫及攻毒保护效果评价。