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目的:蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）是由多个可被Ca2+激活的丝氨酸蛋白激酶和苏氨酸蛋白激酶所组成超家族,存在于细胞浆内,是重要的细胞内信号转导分子。PKC存在于包括中枢神经系统在内的多种组织中,在神经元兴奋性的调节、细胞内信号转导、神经递质的释放、突触可塑性等过程中发挥重要作用。在静息情况下,PKC以无活性的形式存在于细胞浆中,当有外界刺激存在时,PKC被激活移位（Translocation）于细胞膜上即膜转位,进而发挥重要的生理功能。我室以往的研究证实,甲醛炎性痛可诱导大鼠脊髓神经元内PKC活化;我室的研究还证实,甲醛炎性痛可诱导大鼠脊髓神经元凋亡。有关PKC激活在脊髓伤害性信息传递及痛觉过敏方面的作用已有一些报道,但PKC是否参与甲醛炎性痛诱导的脊髓神经元凋亡过程尚未见相关报道。Bax蛋白是调控细胞凋亡的相关蛋白之一,能够促进细胞凋亡过程。Bax蛋白存在于细胞浆中,广泛分布于机体各组织,无明显的组织特异性。如果甲醛炎性痛引起PKC活性改变参与伤害性信息传入引起的脊髓神经元凋亡过程,其是否通过影响Bax蛋白表达而影响神经元凋亡尚有待进一步研究加以证实。因此,本实验首先采用流式细胞技术,观察预先鞘内注射PKC抑制剂灯盏花素乙（Chelerythrine chloride,CH）对甲醛炎性痛大鼠L4-5脊髓节段神经元凋亡率的影响,并观察了正常大鼠鞘内给予PKC激动剂佛波醇酯（Phorbol 12-Myrstate-Acetate,PMA）对脊髓神经元凋亡率的影响,探讨PKC在甲醛炎性痛诱导大鼠脊髓神经元凋亡中的作用。在此基础上,采用免疫组织化学方法,观察了甲醛炎性痛诱导大鼠脊髓后角神经元内凋亡相关蛋白Bax表达的改变,并通过鞘内注射PKC激动剂及抑制剂,观察PKC对大鼠脊髓后角神经元凋亡相关蛋白Bax表达的影响,探讨PKC参与甲醛炎性痛诱导脊髓神经元凋亡的机制。1 PKC对甲醛炎性痛大鼠脊髓神经元凋亡的影响25只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体重280±20克,随机分为5组,分别为正常对照组（control组）,甲醛组（F组）、甲醛+鞘内注射溶剂DMSO组（F+DMSO组）,甲醛+鞘内注射PKC抑制剂CH组（F+CH组）,正常大鼠鞘内注射PKC激动剂佛波醇酯组（PMA组）,每组5只动物。Control组不做任何处理,直接断头取材。F组于大鼠右侧足底注射甲醛后,3d时断头取材;F+DMSO组和F+CH组大鼠预先鞘内注射10μlDMSO或CH溶液,15分钟后于右侧足底注射甲醛,于甲醛注射后3d时取材。PMA组于正常大鼠鞘内注射10μl PMA后,于鞘内注射PMA后3d时取材。采用流式细胞技术检测脊髓神经元的凋亡率。结果发现,正常大鼠鞘内注射PMA后,动物出现烦躁不安,搔抓盒底、舔咬物品和自发退缩等伤害性感受行为,表明鞘内注射PMA可诱导正常大鼠产生自发痛反应。流式细胞技术检测结果发现,control组大鼠L4-5脊髓神经元凋亡率很低。与control组相比,F组大鼠L4-5脊髓神经元凋亡率明显增高（P<0.01）;与F组相比,F+DMSO组脊髓神经元凋亡率无显著性差异,表明鞘内注射溶剂DMSO对脊髓神经元凋亡率无明显影响。与F组相比,F+CH组大鼠脊髓神经元凋亡率明显降低（P<0.01）。与control组相比,PMA组大鼠脊髓神经元凋亡率则表现为明显升高（P<0.01）。以上结果表明,PKC可以促进脊髓神经元凋亡,在甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓神经元凋亡过程中,PKC起促进神经元凋亡的作用。2甲醛炎性痛诱导大鼠脊髓后角神经元凋亡相关蛋白Bax表达改变及其PKC对Bax蛋白表达的影响2.1甲醛炎性痛诱导脊髓后角神经元凋亡相关蛋白Bax表达改变25只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体重280±20克,随机分为5组,分别为正常对照组（control组）、甲醛12h组（F12h组）、甲醛1d组（F1d组）、甲醛2d组（F2d组）、甲醛3d组（F3d组）,每组5只动物。Control组不做任何处理,直接断头取材。甲醛各组动物均于足底注射甲醛后相应时间点断头取L4-5脊髓节段,应用免疫组织化学方法观察L4-5脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层神经元Bax蛋白的表达。结果发现,大鼠右后足底注射甲醛后,立即出现舔、摇、和自发性缩足等自发痛行为,且注射部位出现红、肿等明显的炎症反应,表明动物出现了炎性痛。免疫组化检测结果发现,control组大鼠L4-5脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层Bax免疫反应阳性细胞面积较小,细胞染色较浅。与control组相比,足底注射甲醛后12h,大鼠两侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层Bax免疫反应阳性细胞面积有所增大（P<0.01）,但阳性细胞平均光密度值增加不明显（P>0.05）,表明Bax表达已有所增加;足底注射甲醛1d时,大鼠脊髓后角Bax免疫反应阳性细胞面积进一步增大（P<0.01）,达到峰值,免疫反应阳性细胞平均光密度值也明显增加（P<0.01）,表明细胞染色也明显加深;与F1d组比较,F2d组大鼠脊髓后角Bax免疫反应阳性细胞面积以及阳性细胞染色深度均开始下降,但均高于control组水平（P<0.01）;F3d组大鼠Bax免疫反应阳性细胞面积仍高于control组水平（P<0.01）,但阳性细胞平均光密度值已接近正常对照组水平（P>0.05）。同组动物左右两侧脊髓后角相比,Bax免疫反应阳性细胞面积以及阳性细胞染色深度均无明显差异。以上结果表明,甲醛炎性痛可诱导两侧脊髓后角神经元Bax蛋白表达增加,于注射甲醛后1d时达到高峰。2.2 PKC对甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓神经元凋亡相关蛋白Bax的影响25只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体重280±20克,随机分为5组,分别为正常对照组（control组）、甲醛组（F组）、甲醛+鞘内注射溶剂DMSO组（F+DMSO组）,甲醛+鞘内注射PKC抑制剂CH组（F+CH组）,正常大鼠鞘内注射PKC激动剂佛波醇酯组（PMA组）,每组5只动物。Control组不做任何处理,直接断头取材。F组于大鼠右侧足底注射甲醛后1d时断头取材;F+DMSO组和F+CH组大鼠预先鞘内注射10μlDMSO或CH溶液,15分钟后于右侧足底注射甲醛,于注射甲醛后1d取材。PMA组于正常大鼠鞘内注射10μlPMA后,于鞘内注射PMA后1d取材。应用免疫组织化学方法观察大鼠L4-5脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层Bax蛋白的表达改变。结果发现:与control组比较,F组大鼠L4-5节段脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层Bax蛋白表达明显增加,表现为Bax免疫反应阳性细胞面积增大（P<0.01）,免疫反应阳性细胞染色加深,平均光密度值升高（P<0.01）。与F组比较,F+DMSO组大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层Bax免疫反应阳性细胞面积及平均光密度值均无显著性差异（P>0.05）,表明鞘内注射溶剂DMSO对炎性痛大鼠脊髓后角Bax蛋白表达无明显影响。与F组比较,F+CH组大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层Bax免疫反应阳性细胞面积明显减少,阳性细胞染色明显变浅（P<0.01）。与control组相比,PMA组大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层Bax免疫反应阳性细胞面积以及平均光密度值均明显增加（P<0.01）。以上结果表明,鞘内注射PKC的抑制剂CH可抑制伤害性信息传入诱导的脊髓神经元Bax蛋白的表达;鞘内注射PKC的激动剂PMA可促进脊髓神经元Bax蛋白的表达。结论:1本研究结果证实,PKC抑制剂可抑制甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓神经元凋亡过程,PKC激活可促进正常大鼠脊髓神经元凋亡。2大鼠足底注射甲醛可诱导大鼠脊髓后角Bax蛋白表达增多,并在注射甲醛后1d增加最为明显。正常大鼠鞘内给予PMA可诱导大鼠伤害性感受反应以及脊髓后角Bax蛋白表达增多;预先鞘内注射CH可明显抑制甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓后角Bax蛋白表达。3这些结果表明,PKC在甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓神经元凋亡过程中起促进作用,影响Bax蛋白表达可能是PKC诱导神经元凋亡的重要途径之一。