基于纳米材料的FT-SPR增敏传感器构建及在PRRSV检测中的应用研究

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傅里叶变换表面等离子体共振(FT-SPR)生物传感器是通过待测物与传感器芯片表面的结合,导致入射光折射率发生变化,从而实现待测物高灵敏度和选择性检测的一种新型生物传感分析技术,主要被应用于分析检测、生物学、药理学和环境研究等各个领域;医用纳米材料由于其好的生物相容性及特殊的生物效应被广泛应用于临床前基础医学研究中。其中金纳米团簇材料(AuNCs)具有尺寸小、光学性能好且可调控、良好的稳定性和生物相容性等优点,常被应用于分析检测以及生物医学领域的基础性研究;氧化石墨烯(GO)表面富含有羧基、羟基、环氧基等官能团,增加了其修饰改型能力,具有良好的生物相容性;猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种由猪蓝耳病病毒(PRRSV)引起的高度传染性疫病,目前针对该病毒检测主要围绕核酸检测,但是存在样品假阴性高、耗时以及未能实现未损样品直接检测等缺点。基于此,本课题选用不同功能肽为模板合成了四种功能金纳米团簇材料,将制备的金纳米团簇材料及氧化石墨烯应用到对SPR增敏分析研究中,实现对PRRSV的增敏检测,此外实验还初步研究了团簇材料的抑菌效果。具体内容如下:第一部分以不同链长的肽为模板,改变制备条件,合成了不同多肽配体修饰的金纳米团簇材料(GSH-AuNCs、CV-AuNCs、CY-AuNCs、BSA-AuNCs),通过超分辨透射电镜(HR-TEM)、荧光光谱、紫外光谱、动态光散射(DLS)对材料的物化性能进行表征。通过团簇材料对TMB催化活性分析,研究材料的类酶催化活性。通过溶血实验及细胞CCK-8活度检测实验对材料的生物安全性进行初步探究。最终通过构建SPR生物传感器对不同材料的增敏效应进行对比分析。结果显示制备的功能金团簇材料尺寸在2nm以下,且分布比较均匀,在紫外灯下发强烈的荧光,稳定性比较好,具有类过氧化物酶活性。通过溶血实验及CCK-8细胞活度试验分析,合成的金纳米团簇具有良好生物安全性。在探索链长效应对SPR生物传感器的增敏效果分析中,金纳米团簇具有明显的尺寸依赖性,且与配体链长具有密切相关性。实验结果显示GSH-AuNCs的增敏效果不明显,CY-AuNCs的增敏效果为1.32倍,CV-AuNCs的增敏效果为1.56倍,BSA-AuNCs的增敏效果为2倍,且重现性好,实验结果表明随着肽链的增长增敏效果越来越好,且间接证明了团簇弱的表面等离子体共振效应。本实验结果为通过改变金团簇材料配体来实现研究靶向团簇材料类分子与目标分析物的相互作用关系提供了新思路和新理论。第二部分研究了氧化石墨烯的SPR增敏效应。通过扫描电镜、红外等表征手段对氧化石墨烯的形貌及结构进行了表征。为探究构建SPR生物传感器过程中修饰条件的影响,本实验对氧化石墨烯加入方式、浓度、时间等条件的影响进行了探索。在最佳实验条件下,与先前制备的金纳米团簇材料的增敏效果进行比较。最后,在最优化的实验条件下,通过靶向肽修饰的氧化石墨烯SPR生物传感器实现对PRRSV进行实时在线检测,并与靶向PRRSV的CY肽检测效果进行对比。结果显示氧化石墨烯呈现片状、表面富含羟基、羧基、环氧基等官能团,具有很好的生物相容性,同时在制备传感器时最佳修饰条件为将金片浸泡在2.0 g/L的氧化石墨烯中5 h,同时结果显示氧化石墨烯的增敏效果高于制备金纳米团簇材料的增敏效果,氧化石墨烯的修饰可以使SPR传感器信号增强约2.9倍,且木瓜蛋白酶浓度在50-500 mg·L-1的范围内浓度变化与SPR生物传感器波数变化存在良好的线性关系,线性方程分别为y=0.306x+91.8,线性相关系数分别为R~2=0.99438。将其应用于对PRRSV的检测,结果显示增敏效果大约为2.8倍,建立了利用SPR传感器快速实时检测PRRSV的新方法。第三部分运用功能多肽合成了具有蓝色荧光的CV-AuNCs,并应用于抗菌初步探究实验。通过荧光光谱、紫外光谱、红外光谱对材料的物化性能进行表征,通过溶血实验对材料的生物安全性进行初步评价。通过改变孵育浓度研究了浓度对抑菌效果的影响。结果显示CV-AuNCs最大激发在320 nm处,最大发射在400 nm处,且具有良好的稳定性。分别将100μM、250μM以及500μM的金团簇材料应用于金黄色葡萄球菌(S.aureus)及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌活性实验中,结果表明,在体外培养中,CV-AuNCs对S.aureus及MRSA均有抑制作用,并随着金团簇材料浓度的增大,抑菌效果越明显,并通过对抑菌率的计算得出当材料浓度达到500μM时,对两种菌的抑菌率菌大于50%,表明实验合成的CV-AuNCs(蓝)对S.aureus和MRSA两种细菌有良好的抑菌效果,实验为研究新型抗菌类材料提供新的方法。
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