产漆酶茶叶内生真菌的筛选、酶的分离纯化及酶学特性的研究

来源 :福建师范大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:olddai1
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漆酶是一类含铜多酚氧化酶,催化氧化不同种类型的底物已达200余种,广泛应用于食品工业、废水处理、造纸工业、环境监测等领域。本论文是从茶叶内生真菌筛选产漆酶的菌株,分析不同营养因素和培养条件对真菌产漆酶的影响,并优化培养基成分和培养条件;在此基础上,分离纯化漆酶,分析粗酶液对茶多酚的生物转化效果。采用6种显色底物的平板初筛和酶活性测定的复筛方法,从15株茶叶内生真菌菌株中筛选获得1株产漆酶酶活较高的菌株CSN-4。分析不同营养因素和培养条件对菌株漆酶酶活力的影响,以及培养基成分和培养条件的正交试验,获得到菌株CSN-4最适液态发酵培养基组成为:麸皮30.0 g/L、蛋白胨2.25 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.2 g/L、MnSO4 ·5H2O 0.5 g/L、 CuSO4·5H2O 0.0175 g/L、茶水6g/L。最佳的发酵条件为:接种量为6个菌饼(直径为6 mm),装液量60 mL/250 mL,pH(4.8)自然,转速120 r/min,温度28℃。通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素阴离子层析和葡聚糖G-150凝胶层析等方法分离纯化漆酶,纯化倍数为8.98,回收率为24.88%,漆酶相对分子质量约为70 kDa。对纯化后的漆酶酶学性质进行研究,漆酶的最适温度为60℃,最适pH 4.0,漆酶在35℃以下保温1h,仍能保存95%以上的酶活,在温度大于50℃保温1h,剩余酶活在60%以下,该漆酶在高温条件下,热稳定性比较差。漆酶在25℃条件下pH4-6保持4 h,酶活保持在96%以上,在pH大于8条件下保持4h,剩余酶活在26%以下,此漆酶在酸性条件下更稳定。低浓度Cu2+对漆酶酶活有促进作用,当Cu2+浓度大于5 mmol/L时,对漆酶具有一定抑制作用。初步研究了漆酶对茶多酚的转化效果,分光光度计法和HPLC检测的结果显示,漆酶粗酶液对茶多酚溶液转化效果明显,转化后儿茶素EC、ECG这两种物质含量下降,分别下降了17.28%和28.6%,而EGCG这种物质的含量明显变多,增加量达到81.04%。平板筛选得到产漆酶的内生真菌CSN-4,经过培养基和培养条件优化后,漆酶酶活提高了约24倍。菌株CSN-4液体发酵产生的漆酶能使茶多酚溶液发生转化。
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