背景:肝癌是常见恶性肿瘤之一,肿瘤转移是影响肝癌患者预后和生存的最主要原因,探索肝癌转移的分子机制、寻找肿瘤转移诊断及治疗的潜在靶点具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约18-24个碱基的内源小分子非编码RNA,可通过与靶基因mRNA的3′端非编码区(mRNA-3′-UTR)的特定位点碱基互补结合,导致mRNA降解或抑制其翻译,从而在转录后水平负性调控靶基因的表达。miR-429是miR-200家族成员之一,其异常表达与肿瘤的发生、发展、预后、转移、凋亡、耐药等密切相关。靶基因预测软件发现CRKL是miR-429的潜在靶基因,本组前期研究表明CRKL与鼠肝癌Hca-P细胞、血癌K562细胞的迁移、侵袭、增殖、克隆形成能力相关。但miR-429-CRKL axis在肝癌中的具体作用分子机制不清,本论文主要研究miR-429靶向作用于CRKL调控肝癌细胞恶性行为的作用机制。目的:1、阐明miR-429靶向结合于CRKL-3′-UTR抑制CRKL的表达;2、揭示miR-429和CRKL的负性关系;3、明确miR-429、CRKL对HepG2细胞体外增殖、克隆形成、迁移、侵袭等恶性表性的影响;4、探讨miR-429-CRKL axis调控肝癌细胞生物行为分子机制。方法:1、构建双荧光素野生型psicheck-2-crkl-3′-utr-wt及突变型psicheck-2-crkl-3′-utr-mut重组表达载体,双荧光素酶报告实验检测mir-429与crkl-3′-utr的靶向结合;2、瞬时转染mir-429模拟物及其nc、mir-429抑制剂及其nc,qrt-pcr和westernblot检测mir-429对内源性crkl表达水平变化的影响;3、根据crkl的mrna序列,设计针对crkl的sirna,同时设计无关序列作为阴性对照,采用lipofectaminetm2000将pgpu6/gfp/neo-shcrkl及pgpu6/gfp/neo-shnc分别转染至hepg2细胞中,经g418筛选获得crkl表达稳定下调的单克隆细胞株,qrt-pcr和westernblot检测crkl的表达水平及crkl下调对内源性mir-429表达水平变化的影响;4、扩增crklcds区全长序列、构建pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-crkl重组表达载体,pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-crkl及pcdh-ef1-mcs-t2a-puro分别瞬时转染至hepg2细胞中,qrt-pcr和westernblot检测crkl的表达水平及crkl上调对内源性mir-429表达水平变化的影响;5、mtt检测mir-429、crkl对hepg2细胞增殖能力的影响;6、平板克隆形成实验检测mir-429、crkl对hepg2细胞克隆形成能力的影响;7、transwell检测mir-429、crkl对hepg2细胞迁移、侵袭能力的影响;8、细胞外基质黏附及淋巴结黏附检测mir-429、crkl对hepg2细胞与细胞外基质黏附、淋巴结粘附能力的影响;9、fitc-phalloidin标记f-actin检测mir-429、crkl对hepg2细胞f-actin细胞骨架的影响;10、rescue实验验证crkl上调是否反转mir-429对hepg2细胞迁移、侵袭的抑制作用;11、qrt-pcr、westernblot检测mir-429、crkl对hepg2细胞raf/mek/erk通路和emt相关分子表达变化的影响;12、erk特异性抑制剂pd98059阻断raf/mek/erk通路后,mir-429、crkl对emt相关分子表达变化及hepg2细胞迁移、侵袭能力的影响。结果:1、双荧光素酶报告实验检测发现:与mir-nc相比,mir-429与psicheck-2-crkl-3′-utr-wt共转染后使荧光素酶活性下降了45.67±1.07%(p=0.004);mir-429与wt2共转染后使荧光素酶活性下降了37.00±0.85%(p=0.0008);mir-429与wt1、mut1、mut2共转染后对荧光素酶活性没影响。说明mir-429直接靶向crkl的3′端非编码区第二个结合位点;2、westernblot结果表明:mir-429上调使内源性crkl蛋白下调了55.00±1.51%(p=0.0089);mir-429下调使内源性crkl蛋白上调了44.33±1.05%(p=0.0038);qrt-pcr结果表明:mir-429上、下调对内源性crklmrna表达变化无影响。说明mir-429与crkl-3′-utr结合而阻断其表达,从而在翻译水平负性调控内源性crkl的表达,而对其转录水平无影响;3、获得crkl表达稳定下调的单克隆细胞株,其在蛋白及mrna表达水平分别降低了97.00±0.57%(p<0.0001)和73.33±7.26%(p=0.0005);并瞬转获得crkl过表达的细胞株,其在蛋白及mrna表达水平分别升高了127.30±12.03(p=0.0005)和25400±3329%(p=0.0016);4、mtt及平板克隆形成结果表明:mir-429上、下调对hepg2细胞增殖、克隆形成能力无影响;crkl下调抑制hepg2细胞的增殖能力,在72h和96h,与hepg2-shnc相比,hepg2-shcrkl细胞增殖分别抑制了50.76%和56.36%,且crkl下调抑制hepg2细胞的克隆形成能力;crkl上调促进hepg2细胞的增殖能力,在72h和96h,与hepg2-pcdh相比,hepg2-pcdh-crkl细胞增殖分别促进了16.99%和39.24%,且crkl上调促进hepg2细胞的克隆形成能力。说明crkl只有上调或下调到一定程度才对增殖、克隆形成能力有影响;5、transwell结果表明:mir-429上调抑制hepg2细胞的迁移、侵袭能力,与hepg2-mir-nc相比,hepg2-mir-429细胞迁移、侵袭能力分别降低了48.03%(p=0.0003)和47.56%(p=0.0045);mir-429下调促进hepg2细胞的迁移、侵袭能力,与hepg2-lna-mir-nc相比,hepg2-lna-mir-429细胞迁移、侵袭能力分别升高了57.24%(p=0.0006)和53.28%(p=0.001);crkl下调抑制hepg2细胞的迁移、侵袭能力,与hepg2-shnc相比,hepg2-shcrkl细胞迁移和侵袭能力分别降低了61.73%(p<0.0001)和46.88%(p=0.0001);crkl上调促进hepg2细胞的迁移、侵袭能力,与hepg2-pcdh相比,hepg2-pcdh-crkl细胞迁移和侵袭能力分别升高了73.55%(p=0.0001)和60.19%(p=0.0001);6、细胞外基质粘附、淋巴结粘附、鬼笔环肽结果表明:mir-429上调抑制hepg2细胞与细胞体外基质粘附能力,与hepg2-mir-nc相比,hepg2-mir-429细胞与细胞外基质粘附能力降低了32.78%(p<0.0001);mir-429上调抑制hepg2细胞与淋巴结粘附能力,与hepg2-mir-nc相比,hepg2-mir-429细胞与体外淋巴结粘附能力降低了32.97%(p=0.0055);mir-429上调抑制hepg2细胞f-肌动蛋白表达,与hepg2-mir-nc相比,hepg2-mir-429细胞f-肌动蛋白微丝明显减少;crkl下调抑制hepg2细胞与细胞体外基质粘附能力,与hepg2-shncshnc相比,hepg-shcrkl细胞与细胞外基质粘附能力降低了40.19%(p<0.0001);crkl下调抑制hepg2细胞与淋巴结粘附能力,与hepg2-shnc相比,hepg2-shcrkl细胞与体外淋巴结粘附能力降低了73.13%,(p<0.0001);crkl下调抑制hepg2细胞f-肌动蛋白表达,与hepg2-shnc相比,hepg2-shcrkl细胞f-肌动蛋白微丝明显减少。进一步说明mir-429和crkl影响hepg2细胞的迁移、侵袭能力;7、qrt-pcr结果表明:crkl下调促进mir-429的表达,与hepg2-shnc相比,hepg2-shcrkl细胞中mir-429表达水平升高了102.80±20.05(p=0.0069);crkl上调抑制mir-429的表达,与hepg2-pcdh相比,hepg2-pcdh-crkl细胞中mir-429表达水平降低了92.37±3.19%(p=0.0009)。说明crkl负向调控mir-429的表达,mir-429与crkl可以互相调控;8、rescue实验结果表明:由于外源性pcdh-crkl不含有3′-utr,所以mir-429不能抑制外源性crkl的表达,从而crkl过表达可以反转mir-429对hepg2细胞迁移、侵袭的抑制作用。进一步说明mir-429只能靶向作用于crkl-3′-utr负性调控crkl的表达;9、mir-429和crkl影响raf/mek/erk信号通路及emt。crkl下调和mir-429上调均抑制raf、p-raf、p-mek、p-erk2的表达,crkl上调和mir-429下调均促进raf、p-raf、p-mek、p-erk2的表达,但crkl和mir-429对ras和erk1/2的表达变化无影响;crkl下调和mir-429上调均促进上皮细胞分子e-cadherin的表达,抑制间质细胞n-cadherin和vimentin的表达,从而抑制emt,crkl上调和mir-429下调均抑制上皮细胞分子e-cadherin的表达,促进间质细胞分子n-cadherin和vimentin的表达,从而促进emt;crkl下调抑制c-jun的表达,CRKL上调促进c-Jun的表达,miR-429上、下调对c-Jun的表达均无影响。说明CRKL通过调控c-Jun影响HepG2细胞的增殖能力,miR-429不调控c-Jun的表达,与前面实验miR-429对HepG2细胞的增殖无影响相对应;10、ERK抑制剂PD98059阻断Raf/MEK/ERK通路后,E-cadherin表达增加,N-cadherin和Vimentin表达被抑制,从而抑制EMT,说明Raf/MEK/ERK通路调控EMT;且Raf/MEK/ERK通路阻断后,PD98059加剧了miR-429对HepG2细胞迁移、侵袭的抑制作用,抑制了CRKL对HepG2细胞迁移、侵袭的促进作用。说明miR-429-CRKL axis通过Raf/MEK/ERK-EMT通路调控HepG2细胞的迁移、侵袭能力。结论:1、miR-429靶向作用于CRKL-3′-UTR在转录后蛋白翻译水平负性调控CRKL的表达;2、CRKL负性调控内源性miR-429的表达;3、miR-429影响HepG2细胞体外迁移、侵袭能力,但对增殖、克隆形成能力无影响;4、CRKL影响HepG2细胞体外迁移、侵袭能力,但CRKL只有上调或下调到一定程度才对增殖、克隆形成能力有影响;5、miR-429靶向作用于CRKL通过抑制Raf/MEK/ERK-EMT通路调控HepG2细胞的迁移、侵袭能力。