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乙型病毒性肝炎仍是一个世界性的公共卫生问题,全球范围内乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的慢性感染人群高达3.5亿以上。HBV相关的慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure, ACLF)是慢性肝炎患者死亡的重要原因,如果不进行肝移植,其死亡率高达60-80%,每年大约有22600的患者死于肝衰竭。长期以来宿主免疫一直被认为是乙型肝炎加剧的主要原因,但是近年的研究结果表明病毒因素在ACLF的发病中同样起重要作用。HBV是嗜肝病毒家族的一员,其DNA全长约为3200个核苷酸,呈现部分双链环状。HBV基因组包含4个相互重叠的开放性读码框,分别编码HBV表面抗原、核心抗原、聚合酶和多功能的非结构性蛋白X。由于HBV的复制过程包含前基因组RNA的逆转录,其逆转录酶缺乏校正功能,故HBV的突变率显著高于其它的DNA病毒。HBV基因组的突变率可随着病毒的复制不断增加,其中一些突变可能与慢性肝炎的急性加剧相关,可作为ACLF的预警的生物标志物和抗病毒治疗的靶标。近来有研究表明基本核心启动子区的A1762T/G1764A突变与ACLF发病相关,A1846T、G1896A和C1913A/G位点的突变在ACLF患者中发生率显著高于慢性肝炎患者。目前关于HBV突变和ACLF发病的关系主要集中于基本核心启动子区和前核心区,对HBV基因其它部位的研究尚少。ACLF是否有另外的一些HBV突变位点与ACLF发病有关尚不清楚,为此本研究用HBV全基因组测序筛选出与ACLF发病相关的HBV突变,并发现一些新的突变位点,经过扩大样本的验证,以期为ACLF的预警提供依据。方法1HBV全基因测序筛选与ACLF发病可能相关的HBV突变位点1.1Illumina高通量测序。样本来自两组(12例ACLF和12例慢性轻度乙型肝炎(mildchronic hepatitis B, CHB-M))年龄配对、性别和基因型分布无显著差异患者,所有样本HBV的DNA水平均>100,000copies/mL。首先从200μl的血清中提取病毒DNA,分3段重叠扩增HBV全基因组。PCR产物在Genome Analyzer II平台上进行高通量测序,然后处理高通量测序数据。1.2检测上述样本的肝功能指标(ALT, AST, TBIL, PTA), HBV血清标记物和HBV DNA滴度。1.3分析GenBank数据库的HBV基因突变情况：在GenBank数据库中搜索中国地区报道的ACLF和CHB-M相关的HBV全基因序列共258条(ACLF患者序列143条,CHB-M患者序列115条),分析其突变。2HBV突变与ACLF发病的关系的验证2.1样本。来自80例无症状携带者(asymptomatic carriers, ASC)、152例CHB-M、102例慢性重度乙型肝炎患者(severe chronic hepatitis B, CHB-S)和104例ACLF患者,共438例。2.2从200μ1血清中提取HBV DNA,半巢式PCR扩增HBV基因组目标序列,PCR产物行常规Sanger测序。2.3检测上述样本肝功能指标,HBV血清标记物和HBV DNA商度。结果1Illumina高通量测序筛选结果1.1作为质量控制的质粒测序结果显示：所测得的读长36bpDNA序列的不同位置发生测序错误的频率不一致,在20位碱基之后其碱基替换率呈现上升趋势,当位于序列的第30-36个碱基时,测序的错误率显著上升。为了降低错配率,我们截取每个短片段序列前面的20bp进行质粒全长的拼接。质粒序列的总体误差率为0.49%,其中每一百个核苷酸中错配碱基读取频率>4%的核苷酸平均为2.4个,将4%作为区分真实突变和技术误差的界线。1.2T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A为ACLF患者常见的突变位点,在12例ACLF患者中发生上述突变的病例数分别为10例、9例、10例、10例、8例、5例、10例、11例和7例。1.3T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A这9个位点的突变频率在ACLF患者中显著高于慢性轻度肝炎患者(P<0.05或P<0.01)。1.4基本核心启动子区(basal core promoter, BCP)(A1762T/G1764A)突变在12例ACLF和12例CHB-M患者中的发生率均为6例。其突变频率在ACLF患者和慢性轻度肝炎患者未见显著差异。1.5从Genbank数据库下载258条HBV全基因序列,分析上述突变的分布情况发现：T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A在ACLF中的发生率均显著高于CHB-M, G2095A、G2345A和A1762T在ACLF组和CHB-M组间未见差异。分别对HBV B基因型和C基因型患者的突变进行分析发现,在B基因型的患者中,T216C、G285A、A1846T、G1896A和C1913A/G这5个位点突变在ACLF组中显著高于CHB-M组；C基因型患者中,A1846T、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A这5个突变在ACLF组中显著高于CHB-M组。A1762T/G1764A双联突变在B基因型和C基因型的ACLF患者中均未见显著升高。2HBV点突变与ACLF发病的关系的验证结果2.1ACLF组的B基因型比率显著高于其余三组慢性乙型肝炎患者。2.2T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C这7个突变的发生率在ACLF组显著高于ASC、CHB-M和CHB-S组(P<0.05或P<0.01)。2.3T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G这5个位点在HBV基因型B的感染者中显著高于HBV基因型C感染者。2.4对ASC、CHB-M、CHB-S和ACLF患者的B基因型和C基因型毒株的突变进行比较发现：以ASCs为对照组,B基因型毒株感染者中,T216C、G285A、G1896A、 C1913A/G突变在CHB-S和ACLF组中均显著升高；C基因型毒株感染者中,A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C突变在ACLF组和CHB-S组中显著升高。以CHB-M为对照组,HBV B基因型毒株感染者中,T216C、G285A、G1896A、 C1913A/G和A2159G/C在ACLF患者中显著升高；C基因型毒株感染者中,G285A、A1846T/G、G1896A和C1913A/G在ACLF患者中显著升高。当以CHB-S为对照时,基因型B毒株感染者中,A2159G/C和A2189T/C在ACLF组中显著升高。2.5与非ACLF组比较,B基因型毒株的T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、 C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C与ACLF密切相关,而C基因型毒株的G285A、 A1846T/G、G1896A、C1913A/G和A2159G/C与ACLF密切相关。2.6多因素分析显示T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C是ACLF发病的独立危险因素。2.7T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C的两个或以上的联合突变与ACLF发生密切相关。2.8“含C216的联合突变”,“含A/G1913的联合突变”,“含G/C2159的联合突变”对ACLF诊断具有较高的特异性。结论1B基因型病毒感染的慢性乙型肝炎患者更容易发展为ACLF。2T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C突变为ACLF发生的独立危险因素。其中T216C和A2159G/C系本研究新发现的ACLF发病的独立危险因素(T216C位点已申请国际专利,国际申请号PCT/CN2012/071108),提示了HBV S区和核心区突变在ACLF发病过程中可能起着重要作用。3HBV联合突变的分析发现,联合突变在ACLF发病中发挥更为重要的作用。“含C216的联合突变”,“含A/G1913的联合突变”,“含G/C2159的联合突变”对ACLF的诊断特异性较高。4上述病毒突变可作为预测乙型肝炎加剧的分子标志物,为阻止ACLF发病和改善HBV感染者的预后提供依据。