研究目的:T 淋巴细胞免疫球蛋白黏液素 3（T cell immunoglobulin and mucin-3,TIM3）作为重要的新型免疫检查点蛋白之一,对肿瘤微环境的免疫调节起到重要作用。前期研究显示抗PD-1抗体治疗耐受的肿瘤微环境中以TIM3分子代偿性上调尤为显著,其过表达致使T淋巴细胞增殖受抑及细胞因子分泌水平低下。为验证TIM3分子作为肿瘤免疫治疗新靶点的可行性,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除表达于人外周血T淋巴细胞上的TIM3分子,初步研究敲除人外周血T淋巴细胞的TIM3基因对其体外抗肿瘤作用的影响。研究方法:本研究通过电转染的方法将CRISPR/Cas9体系构建的hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒敲除系统共转入EBV 阳性胃癌患者外周血T淋巴细胞,电转24 h后流式细胞仪检测转染效率,同时使用荧光显微镜观察转染质粒荧光阳性的细胞数。其后,在体外培养的过程中观察TIM3基因敲除后T淋巴细胞的增殖活力,流式细胞验证TIM3基因敲除效率以及细胞表型变化。同时以EB病毒阳性胃癌（Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma,EBVaGC）细胞系 AGS-EBV 为靶细胞,采用相应的肿瘤抗原肽活化诱导TIM3基因敲除的抗原特异性T淋巴细胞,以检测TIM3基因敲除前后抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的细胞因子分泌水平及体外杀伤胃癌AGS-EBV能力的变化。研究结果:hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒敲除体系可以通过电转染的方式有效转入人外周血T淋巴细胞,经流式细胞检测转染效率平均达（41.5±3.6）%,基因敲除效率波动在40.0%～50.0%（均P<0.001）;经抗原活化后的基因敲除组T细胞的增殖活性和免疫表型未见明显变化,表面活化分子中仅见HLA-DR较对照组提高（P<0.05）。功能实验显示TIM3基因敲除后的人外周血T淋巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ的水平显著增高（P<0.05或P<0.01）,体外杀伤胃癌AGS-EBV细胞的能力也明显增强（均P<0.05）。研究结论:该研究证实通过CRISPR/Cas9基因编辑技术及质粒电转染系统构建人外周血T淋巴细胞TIM3基因敲除株的方法简易可行,成本较低,且在体外的扩增活化中能够保持TIM3基因表达水平下调,不影响T淋巴细胞体外增殖活性及主要免疫表型的组成,同时具有更强的免疫应答水平以及体外抗肿瘤作用。这一新技术的研发证实了 TIM3分子作为肿瘤过继性细胞免疫治疗靶点的可行性,同时也为基因工程化细胞免疫治疗提供新的思路。