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磷是植物生长发育所必需的营养元素之一,而土壤对磷的吸附固定作用严重限制了植物对磷的吸收和利用。大豆是农业生产中重要的油料和粮食作物,土壤低磷有效性是限制大豆生产的重要因素之一。在长期的演化过程中,植物形成了一系列适应低磷胁迫的机制,其中,紫色酸性磷酸酶(PAPs)在提高植物磷效率的各种生理和生化途径中,都起着重要的作用。因此,鉴定大豆PAP基因家族成员,并对其基因结构、转录调控及对低磷胁迫的响应进行比较研究,对于进一步解析GmPAPs潜在的生理功能十分重要。本研究首先通过已报道的大豆PAP的氨基酸序列在Phytozome网站BLAST查找,鉴定到35个大豆PAPs,并利用生物信息学手段,对PAP基因家族成员的基因结构、保守结构域及系统发育进化史进行了分析;再通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析技术,研究了PAP家族基因对缺磷和共生的表达响应;最后对两个重要基因GmPAP21和GmPAP32进行了进一步的功能分析,结果如下: 1)大豆PAP家族成员的生物信息学分析表明,35个大豆GmPAPs在系统发育进化树中被分为3大组,不同的分组反映了不同PAP成员在结构和生化性质上存在着差异:其中,有32个大豆GmPAPs含有PAP特有的5个保守结构域(DXG/GDXXY/GNH(D/E)/VXXH/GHXH);21个大豆GmPAPs含有20~45个氨基酸N端分泌型信号肽,3个大豆GmPAPs含有线粒体靶向的信号肽;除了GmPAP7未被糖基化修饰外,其余的所有GmPAPs都含有1~10个与N连接的N-糖基化位点;启动子元件分析结果发现,GmPAP21和GmPAP32的启动子区均含有与磷饥饿和活化根瘤有关的元件,其中GmPAP21的启动子区还含有根毛顺式作用相关元件; 2)大豆水培试验表明,磷有效性显著影响大豆的生长和磷吸收,供磷能显著提高大豆植株干重、磷含量和总根长;大豆PAP家族基因对缺磷和共生响应的表达模式分析表明,在低磷条件下,有23个大豆GmPAP基因在不同组织部位中受到磷饥饿诱导或增强表达,9个基因在低磷处理的根瘤中表达增强:2个基因在低磷条件下接种了丛枝菌根真菌的根部表达明显增强; 3)长短期低磷诱导和非生物胁迫的表达模式分析显示,GmPAP21主要在长期缺磷的根部表达,且在根部对热害和冷害有一定的表达响应,而GmPAP32主要在长期及短期低磷的叶部表达;亚细胞定位分析结果发现,GmPAP21和GmPAP32定位于细胞内的多个部位,包括细胞膜、胞质内及细胞核; 4)GmPAP21在大肠杆菌中的异源表达结果表明,GmPAP21融合蛋白可溶,但纯化后酶活性较低;而GmPAP21过量表达和干涉的转基因毛状根研究结果表明,与转空载体的对照的毛状根相比,在低磷条件下,过量表达GmPAP21能够明显增加转基因毛状根的酸性磷酸酶活性,进而增加转基因毛状根的生物量,表明该基因对植物体内磷的活化及再利用起到了重要的作用。 综上所述,大多数GmPAPs基因可能参与了植物体内磷的吸收和循环再利用,基因GmPAP21很可能对植物体内磷的活化及再利用起到了非常重要的作用,研究结果也为GmPAP基因家族成员在低磷条件下可能参与植物与根瘤菌和丛枝菌根真菌共生响应提供了证据。