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食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。我国是食管癌的高发国家,发病率居全世界之首。在我国食管癌最主要的病理类型是鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。因为早期缺乏明显的临床症状和有效的筛查手段,大多数食管癌患者就诊时已经处于中晚期。目前中晚期食管癌患者的术后5年生存率仅为15-20%,所以研究食管癌的发病机制,寻找早期诊断的分子标志和临床治疗的潜在靶点,对于改善食管癌预后具有重要的意义。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一类长度大于200核苷酸、不具有蛋白编码能力的转录本,主要由RNA聚合酶II转录,具有和mRNA相似的结构。相较于mRNA,lncRNA在基因组上的转录更广泛并且作用方式更复杂。lncRNA通过碱基互补和二级结构形成的茎环,与RNA、DNA和蛋白相互作用,在表观遗传、RNA转录、转录后加工和剪接等多个层面调控基因表达。随着高通量芯片和测序技术的发展,许多肿瘤相关的lncRNA被鉴定出来,如PCA3、HEIH、MALAT1、GAPLING等,这些lncRNA的表达具有一定的组织特异性,因此常被用作肿瘤早期诊断和提示预后的分子标志物。lncRNA在食管癌中的作用日渐受到重视,目前报道了大量食管鳞癌相关的lncRNA。如血浆中lncRNA POU3F3的表达量有助于食管鳞癌的早期诊断;组织中ENST00000435885.1、XLOC013014和ENS T00000547963.1——lncRNA表达图谱与食管鳞癌患者的预后相关:表明lncRNA的表达异常与食管鳞癌的发生发展密切相关。但是大多数lncRNA在食管鳞癌中的生物功能和作用机制尚不清楚,需要进一步研究。为了寻找食管鳞癌相关的功能性lncRNA,探索lncRNA在食管鳞癌发生发展中的作用及机制,本课题利用芯片分析食管鳞癌组织中的lncRNA表达谱,找到了在食管鳞癌组织中表达上调最显著的lncRNA——肿瘤易感性候选基因9（Cancer susceptibility candidate 9,CASC9）。目前关于CASC9的研究报道比较少,因此CASC9在食管鳞癌发生发展中具有什么样的生物学功能,作用机制怎样,值得我们深入研究。本课题的主要研究内容和结果如下:1、lncRNA芯片筛查及定量PCR检测结果发现,CASC9在食管鳞癌组织及细胞中高表达,CASC9表达量与食管鳞癌大小、TNM分期正相关,提示预后不良。选择5对食管鳞癌及癌旁组织,进行高通量芯片检测,分析食管鳞癌组织中lncRNA和mRNA的表达谱,并采用定量PCR方法验证芯片结果的可信度。构建lncRNA-mRNA共表达网络,预测表达上调最显著的lncRNA的生物学功能。使用定量PCR方法在91例食管癌组织（87例含有配对的癌旁组织）和常见肿瘤细胞中检测该lncRNA的表达量,分析其表达量与食管鳞癌病理特征之间的关系和表达特异性。食管鳞癌组织的lncRNA芯片筛查结果提示lncRNA CASC9在食管鳞癌组织中表达上调最显著,高达355倍。从芯片中随机挑选了3条表达上调的lncRNA（BC017398、RP5-907D15、RP11-417E7）和3条表达下调的lncRNA（CCAT1、LINC00443、NR038940）,使用定量PCR方法进一步检测它们在食管鳞癌组织中的表达量,定量结果与芯片结果一致,增强了的芯片结果的可信度。lncRNA-mRNA共表达网络发现PLAUR、NR1H3和CTLA4与CASC9的相关性最强。生物信息学分析和文献资料显示PLAUR、NR1H3和CTLA4参与细胞增殖、凋亡和生长的调控,提示CASC9的功能与细胞生长相关。组织定量PCR结果发现,CASC9在90.8%（79/87）的食管鳞癌组织中高表达,并且随着肿瘤体积的增大和临床分期的进展,CASC9的表达量会进一步提高,说明CASC9表达量与食管癌大小、TNM分期正相关。高表达CASC9的食管癌患者预后差,提示CASC9在食管鳞癌中发挥癌基因作用,可作为食管鳞癌预后的分子标志。细胞定量PCR结果发现CASC9在常见肿瘤细胞中的表达量均高于正常食管上皮细胞Het-1A,在食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450中的表达量最高,提示CASC9的表达具有一定的细胞特异性。本部分研究结果表明:lncRNA CASC9在食管鳞癌组织中表达上调最显著并具有一定的细胞特异性。CASC9表达量与食管鳞癌大小、TNM分期正相关,提示预后不良。生物信息学预测CASC9的功能与细胞生长相关。2、干扰CASC9显著抑制食管癌细胞的生长,提示CASC9参与了食管鳞癌细胞生长的调控。利用siRNA和慢病毒shRNA干扰食管鳞癌细胞KYSE450和KYSE150中CASC9的表达量,并采用CCK-8、荷瘤小鼠实验、Edu、流式细胞仪技术,检测CASC9对细胞生长、增殖、周期和凋亡的影响。使用Western Blot技术检测CASC9对细胞周期相关蛋白表达量的影响。体外和体内实验证实,干扰CASC9显著抑制食管鳞癌细胞的生长、抑制裸鼠的肿瘤形成,提示CASC9参与了食管鳞癌细胞生长的调控。对CASC9生物功能的进一步研究发现,干扰CASC9显著抑制细胞增殖、增加细胞G1/S期阻滞,降低细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6、CCND1和CCNE2的表达量,但是对细胞凋亡没有显著影响。本部分研究结果表明:CASC9通过影响细胞增殖和周期调控食管鳞癌的生长。3、CASC9通过抑制PDCD4的表达促进食管鳞癌细胞的生长,PDCD4表达量提示患者预后良好。为了明确CASC9促进食管鳞癌细胞生长的作用机制,我们干扰KYSE450中CASC9的表达量,利用芯片检测mRNA表达的变化情况。对差异性表达的mRNA进行GO功能分析,重点关注与细胞生长相关的通路。利用食管鳞癌组织表达谱芯片和定量PCR方法,筛选出受CASC9调控的基因,使用回复实验进一步确认该基因受CASC9调控。统计分析该基因与其他lncRNA表达量的相关性,检测CASC9对该基因的调控是否具有特异性。GO功能分析显示,干扰CASC9显著影响cell cycle arrest、cell proliferation等6个与细胞生长相关的通路。分析组织lncRNA和mRNA表达谱数据,发现上述通路中只有VEGFC、PDCD4、PIK3CA、TMX1、PTHLH 5个基因与CASC9的信号强度线性相关。干扰和过表达KYSE450细胞中CASC9的表达量,使用定量PCR检测这5个基因的表达水平,发现只有程序性死亡基因4（Programmed cell death 4,PDCD4）的表达量变化与CASC9完全一致,提示PDCD4是唯一受CASC9直接调控的基因。定量PCR和Western Blot结果显示PDCD4的mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中均低表达,并且随着肿瘤体积的增大和临床分期的进展,PDCD4 mRNA的表达量会进一步降低;PDCD4表达量提示食管鳞癌患者的良好预后。在食管鳞癌组织中PDCD4表达量与CASC9表达量负相关,指示相反的临床病理特征,进一步提示PDCD4受到CASC9的调控。回复实验发现,干扰PDCD4可以部分挽救干扰CASC9引起的细胞G1/S周期阻滞和CDK6、CCNE2表达量下调,说明CASC9通过调控PDCD4表达影响食管鳞癌细胞的周期。统计分析其他在食管鳞癌中差异表达的lncRNA和PDCD4、CASC9表达量的相关性,发现lncRNA CCAT1、LINC00443、NR038940与PDCD4的表达量正相关,并且与CASC9表达量不相关。lncRNA BC017398、RP11-417E7与CASC9表达量正相关,但是与PDCD4表达量不相关。没有一个lncRNA的表达量与CASC9和PDCD4的表达量同时相关,说明CASC9对PDCD4的调控是特异性的。本部分研究结果表明:PDCD4受到CASC9直接和特异性的调控。在食管鳞癌组织中PDCD4表达量与CASC9表达量负相关,指示相反的临床病理特征。CASC9通过抑制PDCD4的表达促进食管鳞癌的生长。4、细胞核中的CASC9通过招募EZH2至PDCD4启动子,催化PDCD4启动子区域H3K27me3,抑制PDCD4启动子的转录活性,降低PDCD4的表达量。为了研究CASC9调控PDCD4表达的分子机制,我们首先使用生物信息学分析PDCD4可能的调控方式,然后利用RNA-蛋白pull down和RIP实验、FISH和核质分离实验、ChIP和荧光素酶报告基因实验,从CASC9与蛋白相互作用、CASC9细胞亚定位和CASC9对PDCD4启动子转录活性的影响3个方面探索CASC9对PDCD的调控机制。生物信息学分析显示PDCD4启动子富含Zeste2增强子（Enhancer of zeste homolog2,EZH2）的结合位点和H3K27me3信号,提示PDCD4的表达受EZH2调控。在食管鳞癌细胞中干扰EZH2,利用定量PCR和Western Blot检测PDCD4表达量,发现PDCD4mRNA和蛋白的表达量均上调,证实了PDCD4的表达受EZH2调控。RNA-蛋白pull down实验和RIP实验结果发现,CASC9与EZH2存在结合,提示CASC9可能参与EZH2对PDCD4的调控。FISH和核质分离实验结果显示,CASC9在细胞核和细胞质中均有分布,从细胞亚定位角度,提示CASC9可能在表观遗传层面调控PDCD4表达。ChIP实验结果发现,干扰CASC9降低了PDCD4启动子区域EZH2的结合和H3K27me3信号;萤光素酶报告基因结果显示,过表达CASC9显著抑制了PDCD4的转录活性。本部分研究结果表明:CASC9在细胞核和细胞质中均有分布,细胞核中的CASC9通过招募EZH2至PDCD4启动子,催化PDCD4启动子区域H3K27me3,抑制PDCD4启动子的转录活性,从而降低了PDCD4的表达量。综上所述,本课题通过食管鳞癌组织lncRNA表达谱筛查,发现了在食管鳞癌组织中表达上调最显著的lncRNA CASC9。CASC9在食管鳞癌中特异性高表达,与ESCC患者的不良预后相关。过表达的CASC9通过下调PDCD4的表达促进食管鳞癌细胞的生长。CASC9在细胞核与细胞质中均有分布。细胞核中的CASC9通过招募EZH2到PDCD4启动子,催化PDCD4启动子区域H3K27me3,抑制PDCD4基因的转录活性,从而降低了PDCD4的表达量。我们的研究证明了PDCD4的表达受lncRNA调控,并且首次阐明了CASC9调控基因表达的分子机制,为理解lncRNA在食管鳞癌中的生物功能和作用机制提供了新的证据,也为ESCC的早期诊断和预后提供了一个潜在的分子标志物。