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研究背景：前列腺素是广泛存在于人类、哺乳动物组织和体液中的一组重要的活性物质，几乎参与了所有细胞的代谢活动，并且与炎症、免疫、肿瘤等重要病理过程有关，在调节细胞代谢上具有重要作用。除红细胞外，全身各组织均有合成前列腺素的酶系，目前发现有两种环加氧酶（COX-1和COX-2）与前列腺素的合成有关。COX-1在大多数组织中呈低水平持续表达，与维持正常组织细胞的生理功能有关；而COX-2的表达则被严格控制，在大多数生理条件下不表达，只有在病理条件下，因为某些细胞因子、有丝分裂原等诱导才会迅速表达。研究表明，前列腺素合成的限速酶COX-2在人类的肿瘤和炎症组织中高表达，COX-2基因敲除或应用COX-2选择性抑制剂可抑制实验动物肿瘤的发生和肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞的分化、生长和血管生成也与COX-2产生的高水平PGE2密切相关。这些研究表明COX-2及其诱导的PGE2在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用。PGE2是环加氧酶作用于花生四烯酸后的主要产物之一，是与炎症、细胞生长、创伤愈合等过程密切相关的重要介质，通过自分泌或旁分泌的形式发挥其生物学功能。阿司匹林和其他非类固醇类抗炎药物主要是通过抑制COX-2活性和PGE2合成发挥其作用的。流行病学和临床实验研究表明长期使用阿司匹林和其他非类固醇类抗炎药物可以降低多种肿瘤的发病率。这些研究让人们对COX-2和PGE2在肿瘤形成过程中的作用产生了浓厚的兴趣。PGE2主要是通过与G蛋白偶联的EP1、EP2、EP3和EP4受体相互作用发挥其生理作用。EP受体为7次跨膜G蛋白偶联受体，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白偶联。EP受体通过与G蛋白偶联，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内。不同EP受体亚型与不同的G蛋白亚型相偶联。通过大鼠和人胚肾细胞EP受体转染实验，人们推测四种EP受体可能是通过以下信号转导通路发挥作用的：EP1受体与G蛋白的Gq部分偶联，通过增加细胞内钙离子浓度和激活蛋白激酶C而发挥作用，促进细胞生长；EP2和EP4受体与G蛋白的Gs部分偶联，EP2受体通过激活腺苷酸环化酶／促进cAMP生成／激活蛋白激酶A而发挥作用，促进肿瘤细胞生长；EP4受体除了通过激活腺苷酸环化酶／促进cAMP生成／激活蛋白激酶A而发挥作用，还通过激活磷脂酰肌醇3-激酶／激活蛋白激酶B等途径发挥作用，促进肿瘤细胞生长；EP3受体与G蛋白的Gi部分偶联，通过抑制腺苷酸环化酶的活性而发挥作用。近年来许多研究表明COX-2／PGE2在疾病发生、发展中发挥着重要的作用，但是PGE2影响肿瘤细胞生长的确切信号转导机制仍然不十分清楚。因此研究PGE2调控肿瘤细胞生长的信号转导通路对研究肿瘤发生机制及寻找新的肿瘤治疗靶点具有重要意义。研究目的：1．观察前列腺素EP受体在胆管上皮癌细胞HuCCT1、SG231和CCLP1中的表达情况。2．检测PGE2和EP受体对三株胆管癌细胞增殖的影响。3．明确PGE2调控胆管癌细胞增殖是否涉及Erk信号转导通路。4．研究PGE2对第二信使钙离子的影响，探明细胞内钙离子浓度改变在EP受体介导的信号转导通路中的作用。5．初步探索与PGE2促进胆管癌细胞增殖相关的EP受体及其介导的信号转导通路。研究方法：1．常规方法培养胆管上皮癌细胞HuCCT1、SG231和CCLP1。2．用RT-PCR和western blotting实验检测三株胆管癌细胞EP受体表达类型。3．用WST实验检测PGE2、Erk抑制剂PD98059、EP受体选择性激动剂17-P-T-PGE2和EP受体选择性抑制剂SC51322对细胞生长率的影响。4．用激光共聚焦扫描显微镜检测PGE2、EP1受体选择性激动剂17-P-T-PGE2和EP1受体选择性抑制剂SC51322对细胞内钙离子浓度的影响。5．Western blotting实验检测胆管上皮癌细胞中相关信号转导通路蛋白磷酸化水平变化情况。6．使用EP1受体选择性激动剂17-P-T-PGE2和抑制剂SC51322检测EP1受体在相关信号转导通路中的作用。7．使用细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM和EGFR抑制剂AG1478，以明确细胞内钙离子浓度升高及EGFR在相关信号转导通路中的作用。研究结果：1．RT-PCR和western blot实验检测结果表明，胆管癌细胞HuCCT1、SG231和CCLP1均表达EP1、EP2、EP3和EP4四种EP受体。2．WST实验检测显示PGE2、EP1受体激动剂17-P-T-PGE2可促进胆管癌细胞生长，EP1受体选择性抑制剂SC51322可抑制PGE2促起的胆管癌细胞生长。3．激光共聚焦扫描显微镜检测结果表明：PGE2、EP1受体激动剂17-P-T-PGE2可促进胆管癌细胞内钙离子升高，EP1受体选择性抑制剂SC51322可抑制PGE2引起的细胞内钙离子浓度升高。4．Erk抑制剂PD98059可抑制PGE2引起的胆管癌细胞增值。5．PGE2、EP1受体激动剂17-P-T-PGE2可引起胆管癌细胞内Erk磷酸化水平升高，EP1受体选择性抑制剂SC51322可抑制PGE2诱导的Erk磷酸化。6．细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM可抑制PGE2诱导的EGFR磷酸化。7．细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM可抑制PGE2诱导的Erk磷酸化，AG1478（EGFR抑制剂）可抑制PGE2诱导的Erk磷酸化。8．细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM可抑制PGE2诱导的Akt磷酸化，AG1478（EGFR抑制剂）可抑制PGE2诱导的Akt磷酸化。研究结论：本项研究结果表明：在胆管癌细胞中，除了Akt信号转导通路外，PGE2引起的胆管癌细胞增殖还与Erk信号转导通路激活相关，并且第二信使钙离子在其中起着及其重要的作用。PGE2通过EP1受体引起细胞内钙离子浓度升高，导致EGFR磷酸化，从而引起与细胞增殖相关的Erk和Akt信号转导通路的激活。