目的蛋白的表达和生产对于基础研究,如阐述生理活性或结构分析是必需的,在医药科学、生物技术工业中,蛋白生产系统要求将更高,因此对外源基因表达系统的需求也在不断急速增加。表达系统由各种不同的宿主和载体组成。至今发展的许多种表达系统,有的利用大肠杆菌,有的利用芽孢杆菌、链霉菌、黑曲霉、酵母、昆虫及哺乳动物细胞。其中有些表达系统商业上已经为学术研究提供了各种试剂盒,有些应用到工业生产上,如医药和酶的生产。每个表达系统都有其特性,所以有必要了解每个系统的优点和缺点,然后根据目的基因、生产量、最终的目的选择合适的表达系统。总的来说,用原核生物作为宿主表达较高等的真核基因,没有正确的折叠和翻译后修饰等,虽然操作容易,生产成本也低,但有时只能得到没有活性的产物。相比较而言,用动物细胞作为宿主,上面提到的问题可以避免,但操作难、生产水平低、生产成本高,而且哺乳动物系统有产生病毒感染的危险,因此需要寻找更合适的表达系统。基因工程技术的发展极大地提高了有医疗价值的蛋白质的开发与利用,在此之前,蛋白质直接从生物体中提取,数量有限,且不能广泛运用于临床。原核生物和哺乳动物细胞表达系统是生产有生物活性重组蛋白质的两大主要系统。近年来,真核酵母表达系统引起广泛的重视,并逐渐用于药用蛋白质的生产。如何选择合适的表达系统,利用基因工程使外源基因高效表达,生产有重要价值的蛋白产品(如医用蛋白质等),显得尤为重要。近些年,酵母作为一种良好的宿主而受到关注是因为:在酵母中已经发展了分子生物学的研究;建立了合适的培养方法;操作过程简单;在发酵工业应用了一段时间,对其生物特性有一定的了解;其安全性如外毒素的解除已经得到保证等。这里我们介绍用裂殖酵母作为宿主的外源基因表达系统,该酵母同其它酵母相比,与哺乳动物细胞有更多共同的特性。酵母菌有着其它表达系统无法比拟的优越性,因此,许多研究者利用重组DNA技术、克隆技术及酵母表达系统,将外源基因在酵母中进行了高效表达。裂殖酵母就是目前研究和应用最为广泛的表达系统之一。自1981年Hitzeman等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功以来,酵母表达系统的应用日趋广泛,利用酿酒酵母表达系统已表达了许多生物活性蛋白,并且产量很高。作为真核表达系统,裂殖酵母表达外源基因有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。概括如下:(1)酵母是真核生物,毒性比细菌小。(2)酵母繁殖速度快,营养要求低,培养基廉价,便于工业化生产。(3)具有强有力的基因启动子作为外源基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达。(4)高稳定性。该系统的载体能和核基因组进行整合,所以构建的菌株稳定,一般不会出现外源基因随生长繁殖而丢失现象。(5)作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰,使表达的蛋白质获得正确的折叠和N-末端加工,从而使表达出的蛋白具有生物活性。裂殖酵母已成功地应用在重组、翻译、RNA拼接、染色体结构、有丝分裂、减数分裂、细胞周期等方面的研究,日益成为研究细胞生物学和分子生物学的极具吸引力的实验载体。2002年初,裂殖酵母的基因组全序列已测定,是目前已取得基因组全序列的6种真核生物(分别为酿酒酵母、裂殖酵母、拟南芥菜、线虫、果蝇和人)之一。裂殖酵母是目前测得最少表达蛋白基因的真核生物,含有4824个基因。基因组全长13.8 Mb,包括3条染色体,分别为5.7 Mb、4.6 Mb、3.5Mb。基因的上游区比芽殖酵母要长,可能表明其有长的调控区。43%的基因含有内含子,有50个基因与人类疾病基因非常相似,部分甚至与癌症基因相关。裂殖酵母与其它的酵母相比在进化上更高级,基因组的测序更有利于研究外源蛋白在裂殖酵母中的表达。裂殖酵母是单细胞真核生物,与酿酒酵母一样同属于子囊菌,它在孢子外以分裂的方式繁殖,没有观察到出芽,所以称为裂殖酵母。裂殖酵母和酿酒酵母都是通过形成囊孢子进行减数分裂繁殖。但裂殖酵母通过细胞分裂进行增殖(裂殖),而酿酒酵母通过芽殖进行减数分裂繁殖。裂殖酵母最初是从东非粟米啤酒中分离到的,在1890年从东非传到德国,后来进一步得到培养出纯菌种。P.inder首次在1893年的酿造杂志中用德文记录了裂殖酵母,并命名为“pombe”,在斯瓦希里语中是啤酒的意思。他同时也指出该酵母是圆柱形的、两端是圆形的、长约7～15μm、直径约4μm。虽然裂殖酵母在葡萄酒、啤酒、面包工业生产中应用不是很多,但裂殖酵母与酿酒酵母一样,在分子遗传学和细胞生物学方面富有特性,已得到广泛研究。裂殖酵母与更高等的真核细胞有许多相似的性质,这一点不同于酿酒酵母等,它渐渐地被认为是研究分子生物学和真核细胞中一种有用的实验模型。它是研究细胞周期调控、染色体结构、性别分化中的信号转导等最好的实验模型之一。可以利用裂殖酵母通过突变同源物互补分离一些哺乳动物基因。也有可能用人类同源的细胞周期调节因子cdc2功能性代替裂殖酵母中的cdc2基因(与酿酒酵母中CDC28同源)。人类的cdc2系统与裂殖酵母的类似性已在蛋白水平得到证实。在裂殖酵母中的表达载体大体上亦可分为两类。一类是染色体整合型,外源基因在染色体中稳定地保留;另一类是附加型,载体有一个酵母的复制系列,可以在染色体外自主复制,有助于高频转化。现在应用于裂殖酵母中的一些整合型载体,是基于酿酒酵母leu1和ura4基因,与裂殖酵母突变互补,或者基于顺向整合到5S核糖体DNA中。基因组DNA的blot分析表明,通过同源重组,转化子中有目的整合基因的一个和多个拷贝。在裂殖酵母中,通过同源重组整合通常比非同源重组表达频率更高。选择性遗传标记可能会使质粒在裂殖酵母中的整合复杂化。整合的转化子非常稳定,但整合的频率不是很高。在裂殖酵母表达系统中,附加型表达载体的应用很普遍,这一类型的载体包括3个重要元素:裂殖酵母自主复制的复制起点、选择性标记、启动子。外源基因转化到裂殖酵母中的方法有原生质体法、电转导法、醋酸锂法、氯化锂法等,醋酸锂法最常用,每μg可以产生超过10~5个转化子,转化后最常见的用来筛选转化子的标记基因,是酿酒酵母基因LEU2和URA3,分别与裂殖酵母中的leu1和ura4互补,裂殖酵母中相对应的基因leu1、ura4、ade1、ade6、his3、his7,同样也用来作为选择标记。强启动子的选择对于有效表达非常关键。许多启动子,包括糖分解途径中的酶,在酿酒酵母系统中可利用,但只有少数启动子在裂殖酵母中有效,虽然已经报道了有些酿酒酵母启动子在裂殖酵母中成功表达,但在酿酒酵母中高效作用的启动子在裂殖酵母中通常没有活性。研究表明,裂殖酵母中高效作用的糖分解酶的启动子,是adh基因的启动子,编码乙醇脱氢酶,如载体pIRT2、pFL20和pEVPⅡ等。有报道来源于哺乳动物细胞的启动子在裂殖酵母中高效作用。这样的例子有SV40启动子、人的绒毛膜促性腺激素α亚单位启动子、腺病毒区3启动子、HIV-1重复序列启动子、人血清蛋白TATA元件。含诱导启动子的载体表达有毒的蛋白更有效。含可诱导启动子的载体,包括各种含维生素B1阻遏型启动子的质粒。其中使用最广泛的是nm1启动子,基于这一启动子的诱导型载体如pREP系列已经建立并普遍利用,该载体作用的表达受到硫胺的抑制。外源报告基因包括GFP(绿色荧光蛋白)、HA(血凝素)、谷光甘肽S-转移酶等,有利于检验和纯化,已经利用这些启动子成功表达,p REP载体的表达是通过除去硫胺诱导的,对于大规模生产更有潜力。膜蛋白包括细胞色素P450在裂殖酵母中已经高水平表达,如2C9表达的水平是其它酵母系统10倍。细胞色素P450的活化需要另一膜蛋白的表达,即NADPH P450还原酶。通过在转导载体插入NADHP P450还原酶表达单位而构建的转导载体表达还原酶。这一构建与含细胞色素P450的表达载体共转化到裂殖酵母中,得到的表达含有P450和还原酶,而且有高的代谢活性。同样表达还原酶的转导载体可以很方便地应用到各种细胞色素P450分子类和NADPH还原酶的共转化中,以取得在裂殖酵母中共表达的各种细胞色素P450和还原酶。目前,GFP在蛋白质标记,指示基因的表达水平,以及发育生物学研究中基因表达模式的探索等方面,得到越来越广泛的应用,成为活细胞分子水平研究的工具。绿色荧光蛋白(GFP)最初是从水母中分离出来的。在水母中,当受到UV或蓝光照射时,GFP能发出明亮的绿光。GFP有许多优点,如发荧光的特性与物种无关,不需要底物,不需要辅助因子或其他蛋白质等。为了探索利用GFP基因作为报告基因,利用裂殖酵母作表达系统,使用基因元件陷阱载体来筛选高等植物基因元件的可行性,我们用裂殖酵母-大肠杆菌穿梭质粒p REP1作克隆载体,构建了GFP即基因表达质粒,转化裂殖酵母,观察了在抑制条件下和非抑制条件下GFP基因在裂殖酵母中的表达。在荧光显微镜下,用蓝光激发裂殖酵母涂片,观察发现在选择培养基上生长的酵母,粒粒均发出耀眼的绿光。当选择培养基中有硫胺素存在时,所有细胞的荧光都明显变弱,说明GFP基因的表达受到了抑制。在完全培养基上培养的转化酵母,大约只有98%的细胞发绿色荧光。而在丰富培养基(YES)中培养的转化酵母,发绿色荧光的细胞不足千分之一。这可能是由于绝大多数细胞的质粒已丢失,只有极少数的细胞仍带有质粒的缘故,也可能是极少数酵母细胞中GFP基因整合到基因组的结果。以上结果可见,GFP基因在裂殖酵母中表达是十分容易观察的,启动子的强弱很容易区别,蛋白质的定位很容易确定。因此,裂殖酵母转化系统和GFP报告基因相结合,用于高等植物基因元件的分离的研究是完全可行的。裂殖酵母中表达载体将会更进一步发展,这样许多外源蛋白就能在裂殖酵母中生产。表达载体的发展开辟了利用裂殖酵母以低成本大量生产蛋白的途径。载体不仅应用于研究目的如蛋白的结构发现,同样也适用于工业,如医药和酶的生产。对裂殖酵母表达系统的研究,促进了人们对分子生物学领域的认识,裂殖酵母表达系统也将更完善。由于裂殖酵母具有的独特生物性质,因而裂殖酵母基因表达系统将会逐步得到广泛应用。