矮牵牛FT/TFL1基因家族分析及其在开花调控中的功能研究

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花芽分化标志着植物从营养生长转入生殖生长,与植物的开花时间以及物种的繁殖与生存直接相关。开花调控网络一直是植物研究的热点问题,FT/TFL1家族基因在这一过程中发挥着重要的作用。享有“世界花坛花卉之王”美誉的矮牵牛(Petunia hybrida)因其品种繁多,花大色艳,易于转化等特点已成为花卉研究中的模式植物之一。前人已发现几个影响矮牵牛开花时间的基因,然而,矮牵牛诱导开花的完整调控途径仍然模糊不清。为掌握其开花的调控路径并通过基因工程手段在实际生产中达到稳定控制花期、定向培育新品种等目的,本研究以矮牵牛W115为材料,对其FT/TFL1家族基因进行克隆和表达分析,特别针对FT基因和TFL1基因,这两个序列高度同源,但在开花调控中功能相反的基因,进行植物转化、表达模式分析、蛋白互作研究等实验,对它们在矮牵牛开花调控中的功能进行研究。主要研究结果如下:1、在矮牵牛W115中利用同源克隆中得到5个FT-like亚家族同源基因,分别命名为Ph FT1-Ph FT5。它们的g DNA都具有相同的基因结构,它们的c DNA编码的小分子蛋白长度约175个氨基酸、且氨基酸序列之间具有很高的相似性,这说明5个Ph FT-like基因属于FT-like亚家族。q RT-PCR结果表明Ph FT-like基因主要在叶片中表达。昼夜节律分析发现,Ph FT1呈现出与Ph FT2-Ph FT5相反的节律性。通过异源转化拟南芥,发现Ph FT1导致拟南芥晚花,而Ph FT2-Ph FT5导致拟南芥早花,说明5个Ph FT-like基因之间存在基因功能分化现象。通过对矮牵牛同源转化后的转基因植株进行表型观测、数据统计和q RT-PCR检测下游基因表达分析,发现Ph FT1功能为抑制矮牵牛开花,Ph FT4对矮牵牛开花具有促进作用;结合酵母双杂交蛋白检测实验,证明5个Ph FT-like均与Ph FDL、Ph14-4-3存在互作关系,由此推测矮牵牛Ph FT-like与Ph FDL、Ph14-4-3形成蛋白复合体通过调控AP1同源基因的表达最终调控矮牵牛开花。2、经过同源克隆,在矮牵牛W115中共得到6个TFL1-like亚家族同源基因,分别命名为Ph BFT1-Ph BFT2,Ph TFL1a-Ph TFL1d。通过基因结构分析发现这6个基因的g DNA全长结构相同,它们c DNA所编码蛋白的氨基酸数量相近且序列高度一致,说明它们均属于TFL1-like亚家族。q RT-PCR结果说明Ph TFL1-like主要在根部表达,据原位杂交将Ph TFL1-like基因的表达定位在根部皮层。异源转化拟南芥发现Ph TFL1a/c导致拟南芥明显晚花,而Ph TFL1b/d导致拟南芥微弱晚花,说明Ph TFL1-like基因之间可能存在功能冗余现象。通过对Ph TFL1a/c转基因W115阳性植株的表型观测和数据统计结果分析,发现Ph TFL1a/c基因功能为致使矮牵牛根部生长受到明显抑制,进而植株生长量受到制约,开花时间也相应推迟;q RT-PCR检测发现AP1同源基因FBP26、FBP29表达量有变化;与已知招募蛋白的酵母双杂交结果证明4个Ph TFL1-like均不与Ph FDL互作,与Ph14-4-3具有弱互作关系,通过酵母双杂交文库的筛选实验与回复验证,发现Ph TFL1a/c与矮牵牛VDAC2(voltage-dependent anion channel 2)存在互作关系;最终推测矮牵牛Ph TFL1-like通过与Ph VDAC2形成蛋白复合体进而对AP1同源基因表达具有一定的调控,发挥抑制矮牵牛根部生长进而制约植株生长及延迟开花的功能。3、在矮牵牛W115中通过同源克隆得到2个MFT-like同源基因,分别命名为Ph MFT1和Ph MFT2。通过基因结构分析发现这2个基因结构相同且c DNA编码的蛋白氨基酸数量约为175,2个氨基酸序列同源性高,说明Ph MFT1和Ph MFT2属于MFT-like亚家族。通过异源转化拟南芥发现Ph MFT1,Ph MFT2未对拟南芥的开花时间产生显著影响。
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