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卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,临床症状隐匿,早期诊断困难,晚期病人疗效不佳,其死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。其生物学特征为易复发和转移,预后差,死亡率高。目前对于卵巢癌尚缺乏早期诊断的方法,对其发病机制也知之甚少。卵巢癌手术及化疗后的复发率很高,所以进一步研究其发病机理,探索新的治疗方法具有重要的临床意义。
白介素18(IL-18)又名干扰素诱导因子,主要由激活的单核细胞和巨噬细胞、树突状细胞、表皮细胞产生,1995年Okamura等在鼠肝中首次发现。IL-18以非活性的前体蛋白的形式存在,分子量为24KDa,经白细胞介素1β转化酶(ICE)剪切形成18KDa的成熟蛋白形式而发挥生物学作用。IL-18具有抗肿瘤作用,有较强的免疫调节作用,在结构上与白介素-1相似,在功能上与白介素12相似,能够刺激T细胞增殖、增强T细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)。增强NK细胞的细胞毒作用,可诱导活化的Th1细胞产生大量的IFN-γ,活性比IL-12强。并可能通过抑制血管生成而抑制肿瘤细胞生长。目前,关于IL-18、ICE与卵巢癌发生发展的关系以及研究IL-18基因转染后对卵巢癌细胞生物学特性的影响,以及应用IL-18对卵巢癌进行基因治疗的研究在国内外鲜有报道。本课题从三方面进行了研究:
(1)IL-18、ICE在卵巢癌中的表达与卵巢癌的病理类型、临床特点的关系。(2)采用逆转录病毒将IL-18基因转染卵巢癌细胞,观察转染后肿瘤细胞在体外的生长及IL-18的表达情况。(3)观察基因转染肿瘤细胞体内生长情况。为探讨通过基因治疗,阻止卵巢癌的发生、发展,提高生存率,延长生存期奠定理论基础。
第一部分IL-18、ICE在卵巢癌组织中的表达及临床意义的研究
目的:探讨卵巢癌组织中IL-18及ICE的基因表达水平,及它们与卵巢癌生物学特性之间的相互关系。
结果:1)卵巢癌组织和正常卵巢组织及卵巢良性肿瘤组织中均有IL-18mRNA的表达。其IL-18mRNA表达量分别为0.7746±0.3524、1.3015±0.4778、1.0157±0.1676;ICE在32例卵巢上皮癌组织中有29例表达;在正常卵巢组织及卵巢良性肿瘤组织中均有表达,.其mRNA表达量分别为0.6341±0.3420、0.9614±0.5141、0.7349±0.3429。卵巢上皮癌组织中IL-18及ICEmRNA的表达较正常卵巢组织明显减少(P<0.05),良性卵巢肿瘤组织中IL-18及ICEmRNA的表达与正常卵巢组织相比差异无显著性(P>0.05)。
结论:1)卵巢癌组织中IL-18、ICEmRNA表达较正常卵巢组织明显下降,但其表达水平与患者的年龄、病理类型和临床分期无关。人卵巢癌细胞株SKOV3和3AO均有IL-18mRNA表达,没有ICEmRNA的表达。2)卵巢癌组织中IL-18、ICE蛋白表达较正常卵巢组织明显下降;其表达水平虽与卵巢癌患者的年龄、病理类型、临床分期无关,但Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌组织较Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌组织中的表达有降低趋势。人卵巢癌细胞株SKOV3和3AO只有IL-18蛋白表达,没有ICE蛋白的表达。
第二部分IL-18基因转染鼠卵巢癌细胞体外抑瘤作用的研究
目的:研究转入IL-18基因后对OVHM细胞的细胞活性、细胞增殖周期及细胞凋亡的影响
结果:1)分别将逆转录病毒携带的有活性的小鼠IL-18基因(PA317/IL-18)及空载体(PA317/LXSN)基因成功转染至OVHM细胞。得到OVHM/IL-18、OVHM/LXSN细胞。2)只有OVHM/IL-18细胞有383bp的IL-18mRNA和IL-18蛋白表达,而OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞中无IL-18mRNA及蛋白表达。3)三种细胞的体外增殖速度无明显差异。4)转染前后,OVHM/IL-18和OVHM/LXSN细胞折光性好,贴壁良好,细胞内颗粒少,基本形态及生长情况与野生型OVHM细胞比较无明显变化。5)OVHM/IL-18、OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞均无明显凋亡现象,凋亡指数(APOI)、增殖指数(PI)、细胞周期分布无显著性差异(P>0.05)。6)OVHM/IL-18细胞分泌IL-18水平随培养时间的变化而不同,于24小时达到高峰,持续24小时后其表达逐渐减弱;
结论:转染有活性的小鼠IL-18基因的OVHM细胞表达IL-18mRNA及蛋白;IL-18基因对肿瘤细胞的增殖反应无明显抑制作用,未发现导致肿瘤细胞凋亡的现象发生;OVHM/IL-18细胞培养上清比OVHM/LXSN、野生型OVHM细胞能够明显的刺激小鼠脾细胞产生IFN-γ,证明转染IL-18基因后的OVHM细胞可分泌有生理活性的IL-18。
第三部分IL-18基因转染鼠卵巢癌细胞体内抑瘤作用的研究
目的:将IL-18转染OVHM细胞,在裸鼠体内进行成瘤实验,分析IL-18mRNA在体内对肿瘤细胞的抑制作用。
结果:1)接种肿瘤细胞后,连续观察4周,OVHM/IL-18组裸鼠右上肢皮下出现肉眼可见的肿瘤时间较另两组晚,平均出瘤时间为10.5±1.5天,随瘤龄增长肿瘤生长缓慢OVHM/LXSN与OVHM组平均出瘤时间为5.5±1.5天、5.4±0.6,随瘤龄增长肿瘤体积明显增大;接种后4周肿瘤相继出现表面破溃,裸鼠出现食欲差,活动性差,倦怠等症状。3组裸鼠的成瘤率虽然相同;但与OVHM/LXSN和OVHM组裸鼠相比,OVHM/IL-18组裸鼠成瘤潜伏期明显性延长(P<0.01)。2)大体观察:可见OVHM/LXSN组、OVHM组裸鼠瘤组织生长呈结节状,突出于体表,瘤体较大,质脆,易出血,浸润周围的组织和皮肤,界限不清,不易分离,切面晦暗,无明显液化及坏死。OVHM/IL-18组裸鼠肿瘤组织体积小,质脆,易出血,无明显周围组织浸润,易分离。病理组织切片经HE染色镜下可见对照组和空载体组瘤组织为密集排列的瘤细胞,间质少,细胞大小不等,细胞质丰富,细胞核大,深染,大小不一,异型性明显,核分裂相多见,间质血管丰富,偶见脉管瘤栓及肿瘤细胞向周围组织浸润。3)OVHM/IL-18组瘤组织中有IL-18的mRNA表达,而OVHM组及OVHM/LXSN组瘤组织中无IL-18的mRNA表达。OVHM/IL-18组瘤组织中IL-18阳性细胞数及染色强度显著高于OVHM/LXSN组和OVHM组裸鼠瘤组织。4)OVHM/IL-18组发生明显的细胞凋亡,而另两组很少发现细胞凋亡。OVHM/IL-18组裸鼠种植瘤细胞,G0/G1期细胞明显增多(88.69±2.52%),S期细胞明显减少(4.82±1.35%),与OVHM/LXSN组、OVHM组比较有显著性差异(P<0.05)。5)OVHM/IL-18组裸鼠体内瘤细胞增殖活性明显受到抑制。OVHM/IL-18组种植瘤细胞增殖指数明显低于OVHM/LXSN组及OVHM组,有显著性差异(P<0.05)。6)经电镜观察,OVHM/IL-18组裸鼠种植瘤细胞大而不整形,微绒毛数量减少,核大而畸形,有凋亡改变,细胞核固缩,核染色质高度浓缩,电子密度增加,呈新月状边集于核膜下,核膜完整,核孔消失,胞浆浓缩并有空泡出现,线粒体和其它细胞器数量减少,体积变小,粗面内质网轻度扩张,有轻度脱颗粒现象。
结论:转染IL-18的肿瘤细胞在裸鼠体内能够有效的抑制卵巢癌细胞的成瘤性,增加卵巢癌细胞的凋亡;但并不能完全抑制肿瘤的生长,这可能缘于下述原因:1)本实验是用裸鼠制备的动物模型,由于裸鼠缺乏胸腺,即T淋巴细胞免疫系统功能缺乏,而T淋巴细胞尤其是CD4+和CD8+T淋巴细胞在IL-18的抗肿瘤活性方面起重要作用,所以,此部分功能缺乏影响IL-18的抗肿瘤作用;2)肿瘤本身存在一些细胞因子如转化生长因子(TGF-β)、IL-10等促进肿瘤生长,抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能,增强Th2型细胞因子介导的特异性体液免疫反应,由此抵消了部分IL-18的抗肿瘤作用。3)卵巢癌的发生发展受到多种因素影响,单独改变一个基因不足以完全抑制卵巢癌的增殖。
本实验证实IL-18在卵巢癌发生发展中发挥着一定作用,为应用IL-18对卵巢癌进行基因治疗奠定了理论基础。