1、研究背景:膀胱癌是泌尿系常见恶性肿瘤,其中90%病理类型为尿路上皮癌。2018年,膀胱癌发病率在全球范围内居所有恶性肿瘤第10位,约有54.9万新发病例和20万死亡病例。大多数患者为非肌层浸润性尿路上皮癌(NMIBC),其中大约30%进展为肌层浸润性尿路上皮癌(MIBC),其5年和10年生存率分别为50%和36%。转移性膀胱尿路上皮癌患者首选顺铂和吉西他滨联合化疗作为一线治疗方案,但患者的中位生存时间仅为15个月,5年生存率仅为15%。目前,针对膀胱癌肿瘤微环境的免疫治疗已成为研究热点,其中PD-1/PD-L1抑制剂已被美国FD A批准作为既往接受铂类药物化疗后出现进展和转移患者的二线治疗方案,但有效率仅为15.0-36.1%。因此,深入研究影响膀胱尿路上皮癌免疫逃逸的机制,寻找膀胱癌免疫治疗的新靶点具有非常重要的临床意义。程序性细胞死亡受体蛋白1(Programmed cell death-1,PD-1)可表达于T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞。PD-1及其配体PD-L1和PD-L2可以调节T细胞活化与抑制信号以及免疫介导的组织损伤。尽管PD-1在适应性免疫中的作用已充分证明,但其在固有免疫系统中的功能最近才开始研究。研究发现PD-1可通过减少STAT1的磷酸化抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向M1型极化,并通过增加STAT6磷酸化促进向M2型极化。此外,几乎所有的PD-1+TAM表现为M2表型,而PD-1-TAM表现为M1表型。PD-1+M2型巨噬细胞的含量随着疾病分期而增加,说明PD-1+M2型巨噬细胞可能随着时间的推移在肿瘤微环境中积累。因此,M2型巨噬细胞可以通过PD-1介导肿瘤细胞的免疫逃逸机制。研究发现,TAM中PD-1表达水平与巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力呈负相关,阻断PD-1/PD-L1通路可以促进巨噬细胞的吞噬作用,抑制肿瘤细胞的增殖。表明PD-1/PD-L1抑制剂也可通过改善巨噬细胞吞噬作用抑制肿瘤进展。M2型巨噬细胞除了吞噬作用减弱外,还可分泌TGF-β、IL-4、IL-10、Arg-1和NO等免疫抑制因子抑制T细胞对肿瘤抗原的免疫应答。IL-4、IL-10等可直接作用于肿瘤细胞产生不同作用。IL-4是一种多效性细胞因子,在T细胞、B细胞以及非造血细胞中具有增殖、分化和凋亡的作用。IL-4与IL-4R结合激活两种不同的信号转导通路,分别为STAT6通路和胰岛素受体底物通路。在STAT6通路中,STAT6募集磷酸化的酪氨酸残基,并被磷酸化为pSTAT6。pSTAT6形成蛋白质二聚体,并易位至细胞核与IL-4应答基因的特异性DNA元件结合,介导相关的生物学效应。在胰岛素受体底物通路中,磷酸化的IL-4Rα募集胰岛素受体底物-1和胰岛素受体底物-2蛋白,激活PI3K-Akt通路,导致细胞增殖和抗凋亡效应。IL-4的生物学效应根据肿瘤的细胞类型和分化状态而变化。在大多数肿瘤细胞中,IL-4通常促进肿瘤细胞的增殖、转移和抗凋亡基因的表达。但在乳腺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌和肾透明细胞癌细胞中,IL-4诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。目前,IL-4在膀胱尿路上皮癌中的生物学效应尚不清楚。研究发现,结直肠癌患者肿瘤组织中TAM表达PD-1可使TAM向M2型极化,抑制巨噬细胞吞噬作用和肿瘤免疫。胃癌患者肿瘤来源外泌体可诱导TAM表达PD-1并促进肿瘤进展。抗PD-1治疗可使肺癌转移灶中M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化,并抑制肺癌转移灶的进展。既往研究表明,靶向抑制TAM中PD-1的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖,但是否通过抑制肿瘤细胞IL-4/STAT6通路,从而抑制肿瘤的进展,目前没有具体研究。本课题拟研究M2型巨噬细胞高表达PD-1,促进IL-4释放,进而激活膀胱癌细胞IL-4/STAT6通路,从而促进膀胱尿路上皮癌进展的机制,以及针对此机制可能的治疗方法。2、研究目的:研究细胞水平TAM高表达PD-1促进膀胱癌细胞增殖的机制;建立人膀胱尿路上皮癌裸鼠皮下移植瘤模型,研究PD-1抑制剂nivolumab对其作用机制;在临床样本中研究TAM表达PD-1对膀胱癌预后的影响。3、实验方法:3.1肿瘤相关巨噬细胞极化状态与PD-1表达关系的研究THP-1细胞经不同细胞因子诱导,分别分化为M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞,观察不同极化状态巨噬细胞的形态;采用Western blotting、PCR,检测MO、M1及M2型巨噬细胞生物标记物。检测M2型巨噬细胞经siRNA-PD-1干扰和加入nivolumab后,其生物标志物的变化,以及对其分泌IL-4的影响。3.2 Nivolumab通过抑制TAM释放IL-4从而抑制膀胱癌细胞增殖和侵袭的机制研究将膀胱癌细胞T24和5637分别分为6个处理组:.T24/5637组、T24/5637与M2型巨噬细胞共培养组、T24/5637与(M2型巨噬细胞+nivolumab)共培养组、T24/5637+nivolumab组、T24/5637与(M2型巨噬细胞+抗IL-4中和抗体)共培养组、T24/5637+抗IL-4中和抗体组。采用CCK-8实验、transwell实验、Ki67免疫荧光、Western blotting检测不同处理条件下膀胱癌细胞侵袭与增殖能力。3.3 Nivoluma抑制TAM激活膀胱癌IL-4/STAT6通路并抑制膀胱癌增殖和侵袭的裸鼠皮下移植瘤模型研究建立膀胱癌细胞5637裸鼠皮下移植瘤模型。将16只裸鼠右上肢外侧皮下接种5637膀胱癌细胞,建立皮下移植瘤模型,将16只裸鼠随机分为实验组和对照组,实验组予nivolumab 10mg/kg/次腹腔注射,每5天一次,共5次,第五次注射5天后,处死裸鼠,剥取移植瘤。每次给药前及处死前测量裸鼠体重及肿瘤体积,绘制生长曲线。移植瘤采用免疫组化、免疫荧光双标记等评估肿瘤组织内TAM浸润密度及TAM的PD-1阳性率和IL-4阳性率。3.4膀胱癌组织中M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率对膀胱癌患者预后影响的研究收集71例行膀胱肿瘤电切或行根治性膀胱切除术后患者的组织标本,采用免疫荧光及免疫组化检测膀胱癌组织及癌旁组织中M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率,评估其与临床病理参数的关系,以及对总生存时间和预后的影响。3.5统计学分析所有检测、数据读取等步骤重复进行3次,应用R语言(3.6.1)进行统计学分析。呈正态分布的计量数值以X±S表示。两组数据之间的差异比较采用T检验分析。多组数据之间的差异比较采用单因素或多因素方差分析。临床研究部分,采用卡方检验和Fisher’s精确检验确定M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率与临床病理参数的相关性。生存率采用Kaplan-Meier曲线,log-rank检验计算生存曲线差异。采用单因素和多因素Cox比例危险模型分析评估预后因素的意义。P<0.05为差异有统计学意义。4、实验结果:4.1 PD-1在M2型巨噬细胞高表达并可促进M2型巨噬细胞极化。(1)THP-1细胞可诱导为M0、M1、M2型巨噬细胞并发生相应形态学改变。(2)Westerm blotting、PCR、ELESA检测证实M1型巨噬细胞高表达CD80、iNOS,M2型巨噬细胞高表达CD163、Arg-1、PD-1、IL-4。(3)经siRNA-PD-1干扰或应用nivolumab后,M2型巨噬细胞向M1型转化,并可使IL-4释放减少。4.2膀胱癌细胞T24和5637与M2型巨噬细胞共培养后,增殖和侵袭能力增强;nivolumab或抗IL-4中和抗体可抑制共培养体系中膀胱癌细胞T24和5637的增殖和侵袭能力(1)CCK-8实验、Ki67免疫荧光检测不同处理组膀胱癌细胞增殖能力,M2型巨噬细胞可显著促进其增殖,向共培养体系中加入nivolumab或抗IL-4中和抗体后,其增殖能力显著降低。(2)Transwell实验检测不同处理组膀胱癌细胞迁移和侵袭能力,M2型巨噬细胞可显著促进其迁移和侵袭,向共培养体系中加入nivolumab或抗IL-4中和抗体后,其迁移和侵袭能力显著降低。(3)Western blotting检测不同处理组膀胱癌细胞pSTAT6、Bcl-2和Bax表达情况,与M2型巨噬细胞共培养的膀胱癌细胞,其pSTAT6、Bcl-2表达显著增加,Bax表达显著降低;向共培养体系中加入nivolumab或抗IL-4中和抗体后,Bax表达显著增加,STAT6、Bcl-2表达显著降低4.3 Nivoluma抑制裸鼠皮下移植瘤组织中TAM激活膀胱癌IL-4/STAT6通路并抑制膀胱癌增殖(1)实验组裸鼠肿瘤体积、肿瘤重量明显低于对照组。(2)对照组中M2型巨噬细胞浸润密度较M1型巨噬细胞显著升高,M2型巨噬细胞PD-1阳性率较M1型巨噬细胞PD-1阳性率显著升高。(3)对照组中M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率较实验组显著升高。(4)对照组pSTAT6、Bcl-2表达强度高于实验组,Bax表达强度低于实验组。4.4膀胱癌组织中M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率对膀胱癌预后的影响(1)MIBC中M2型巨噬细胞浸润密度显著高于NMIBC,M2型巨噬细胞PD-1阳性率也显著高于NMIBC。(2)M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率与膀胱癌病理T分期、病理分级正相关。(3)M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率是膀胱癌的独立不良预后因素。5、实验结论:(1)M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达PD-1,并产生IL-4;PD-1抑制剂nivolumab可使其向M1型巨噬细胞极化,并减少IL-4释放。(2)M2型巨噬细胞释放IL-4并通过膀胱癌细胞IL-4/pSTAT6通路促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭;PD-1抑制剂nivolumab或抗IL-4中和抗体可抑制M2型巨噬细胞对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。(3)裸鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中,nivolumab可使肿瘤组织中M2型巨噬细胞向M1型极化,减少IL-4分泌,通过抑制膀胱癌IL-4/pSTAT6通路抑制皮下移植瘤生长速度。(4)M2型巨噬细胞浸润密度和M2型巨噬细胞PD-1阳性率与膀胱癌病理T分期、病理分级正相关,是膀胱癌的独立不良预后因素。