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目的:口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔中常见的恶性肿瘤,也是最常见的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）,严重威胁着人们的健康。治疗方法通常为手术治疗辅以放化疗,然而其五年生存率仍然不高,因此亟需探究OSCC的发病机制,为提高OSCC患者生存率奠定理论基础。近些年,肿瘤微环境（TME）这一概念被提出,作为肿瘤生存发展的“土壤”在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。在HNSCC中,间质增生明显,存在丰富的肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）,CAFs因其来源复杂,在高度异质的肿瘤细胞影响下存在多个细胞亚群,参与肿瘤的发生,发展、浸润、转移和耐药。间充质干细胞（MSCs）作为多能干细胞被认为是CAFs的主要来源之一,其中,骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为主要的一种MSCs因其具有多分化潜能和免疫调节作用而广泛应用于组织再生领域。但是在癌症中,位于骨髓的BMSCs受到TME中多种细胞的募集可以迁移到肿瘤微环境内并参与肿瘤进展。BMSCs在肿瘤中的作用是多方面的,对肿瘤细胞来说,在不同类型的肿瘤可能发挥促进或抑制的作用,甚至在同一类型肿瘤中作用亦有不同。而在OSCC中,BMSCs的生物学作用也存在争议。因此,本研究旨在探索BMSCs对OSCC的生物学作用及其机制。方法:1)首先进行生信分析,从GEO数据库获得OSCC的sc RNA-seq数据,使用Seurat函数包对其进行降维分群,并获得特异性表达基因,使用Single R函数对各个细胞亚群进行注释。从TCGA数据库获取鳞癌患者的基因表达数据和生存数据,使用Survival函数对细胞亚群进行生存分析,绘制生存分析曲线。2)复苏OSCC细胞系CAL27,Fa Du细胞和BMSCs,收集BMSCs条件培养基,用BMSC-CM与OSCC细胞条件共培养1 d,3 d,5 d用于后续实验。3)CCK-8细胞活性实验检测共培养后OSCC细胞活性,克隆形成实验检测OSCC细胞的干性,细胞周期实验检测其增殖能力,细胞凋亡实验检测OSCC细胞的凋亡,Trans-well迁移实验和划痕实验分别检测OSCC细胞的迁移能力和伤痕愈合能力。4)通过Real-time q PCR和Western blot分别从m RNA和蛋白水平检测OSCC细胞上皮间充质转化（EMT）相关标志物和转录因子的表达情况。ELISA检测BMSCs条件培养基（CM）中TGF-β1含量,使用Western blot检测OSCC细胞中Ras/Raf/ERK信号通路的激活情况。随后,使用TGF-β1抑制剂SB431542和ERK抑制剂U0126预处理OSCC细胞后,通过CCK-8细胞活性实验,Trans-well细胞迁移实验和细胞免疫荧光检测OSCC细胞的增殖、迁移和EMT相关蛋白表达情况。5)利用CAL27细胞、BMSCs-CM处理后的CAL27细胞、抑制剂SB431542和U0126预处理后共培养的CAL27细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,测量生长过程中肿瘤体积,免疫组织化学染色检测Ki67,Vimentin和Snail表达情况。结果:1)生信分析结果显示:OSCC组织的全部细胞被分为17个细胞亚群（cluster）,提取其中的“fibroblast”细胞群进一步聚类分群和差异性分析后,显示12个细胞亚群及其标记基因。其中MSCs标记物表达于cluster 0,5,6,7,8,10这6个亚群,散点图显示MSCs是成纤维细胞的一种重要来源。提取MSCs再次聚类分群和差异性分析后,得到9个细胞亚群及其标记基因,Kaplan-Meier曲线显示,MSCs细胞亚群cluster 5与更差的预后相关,而细胞亚群cluster 8更有利于患者预后,其他细胞亚群对患者生存期无明显影响,因此,我们推测BMSCs作为最常见的一类MSCs,可能在OSCC中发挥促进或抑制的作用。2)在体外实验中,CCK-8细胞活性实验显示,与对照组相比,BMSC-CM共培养后,OSCC细胞数量显著增加。克隆形成实验发现,与BMSC-CM共培养后,OSCC细胞的克隆集落数量均明显增加。细胞周期实验显示共培养后OSCC细胞的细胞周期中S期的细胞比例明显上升。细胞凋亡实验发现,与对照组相比,BMSC-CM共培养的OSCC细胞的早期凋亡和晚期凋亡均显著降低。Trans-well细胞迁移实验发现BMSC-CM处理后的OSCC细胞穿膜细胞数显著增加,并且随着共培养时间的增加而增多。划痕实验显示共培养的OSCC细胞划痕愈合时间缩短。3)Real-time PCR结果显示共培养后,OSCC细胞的E-cadherin的m RNA表达下降,N-cadherin,Vimentin和Snail,Zeb1,Zeb2和Twist的m RNA表达增加。Western blot检测结果显示,与对照组相比,共培养的OSCC细胞中,ZO1,Ecadherin表达下降;Fibronectin,Vimentin,Snail,Slug和Zeb1表达上升。ELISA结果显示BMSC-CM中存在大量TGF-β1生长因子。Western blot检测OSCC细胞中Ras的表达情况和Raf,ERK的磷酸化情况,结果显示,与对照组相比,BMSC-CM共培养组的Ras、p-Raf,p-ERK表达增加。使用了TGF-β1抑制剂SB431542和ERK抑制剂U0126预处理OSCC细胞后,CCK8细胞活性实验发现,与共培养组相比,抑制后OSCC细胞增殖下降。Trans-well细胞迁移实验显示与共培养组相比,抑制后OSCC细胞的穿膜细胞数下降。细胞免疫荧光所示,抑制后OSCC细胞的E-cadherin表达增加,Vimentin表达减少。4)在裸鼠体内的OSCC异种移植模型结果显示,与对照组相比,BMSC-CM处理组肿瘤体积显著增加,抑制剂处理组肿瘤体积明显小于对照组和共培养组。免疫组织化学染色结果发现,与对照组相比,共培养组Ki67呈强阳性,癌巢内可见Vimentin表达,Snail的表达增加。而SB431542和U0126抑制剂组Ki67阳性范围低于对照组,Vimentin仅在细胞间质中可见阳性,而癌巢内表达为阴性。Snail的表达呈阴性。结论:OSCC患者的肿瘤组织中MSCs具有多个细胞亚群,对OSCC可能有不同的生物学影响。体内外实验研究发现MSCs的亚群之一BMSCs可以激活TGF-β1/Ras/Raf/ERK信号通路促进OSCC细胞发生EMT从而促进其增殖和迁移。最终证明MSCs中骨髓来源的亚群BMSCs可以促进OSCC发展。