染料木素抑制轮状病毒的复制及其上调AQP4表达机制研究

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[目的]:  1.构建Wa株及SA-11轮状病毒(rotavirus,RV)株感染的Caco-2细胞模型,检测RV感染的Caco-2细胞胞膜上4种AQPs的mRNA和蛋白的整体表达变化,分析AQPs的表达与RV感染的相关性。  2.检测染料木素体外抗RV感染的总体活性及其对病毒mRNA和结构蛋白VP-6的表达影响。  3.探讨染料木素对RV感染的宿主Caco-2细胞内AQPs表达的影响及其调控AQPs的作用机制。  [方法]:  1.分别采用qRT-PCR及western-blot的方法检测Wa株和SA-11两株RV病毒株感染宿主Caco-2细胞后4种水通道蛋白AQP1,AQP3,AQP4和AQP8的mRNA和蛋白水平的整体表达变化。  2.采用CCK-8的方法检测染料木素对Caco-2细胞的药物毒性;病毒滴度测定法检测染料木素抗RV的吸附作用、抗RV的进入细胞作用和抗RV在宿主内的复制作用;ELISA检测染料木素干预RV感染的Caco-2细胞后对胞内外的RV抗原分泌的影响;IFA法检测染料木素干预RV感染的Caco-2细胞后RV病毒颗粒释放的影响;qRT-PCR、western-blot分别检测染料木素干预RV感染的Caco-2细胞后RVmRNA和结构蛋白VP-6的表达影响。  3.检测染料木素干预RV感染细胞后胞内的AQPs的表达变化以及其对AC和PKA的活性影响;Western-blot检测染料木素干预RV感染的Caco-2细胞后对胞内CREB,p-CREB及下游AQPs蛋白的表达变化。  [结果]:  1.RV-Wa株感染宿主Caco-2细胞12h后,AQP1的mRNA的表达水平与正常对照组相比出现明显下调(P<0.05),但其蛋白表达水平没有出现明显的变化(P>0.05)。AQP4的mRNA和蛋白水平较对照组相比均出现表达下调(P<0.01),AQP3和AQP8的mRNA和蛋白表达水平较正常对照组比没有明显的表达差异(P>0.05)。RV-SA-11株感染Caco-2宿主细胞12h后,AQP1和AQP4mRNA和蛋白水平较对照组相比出现表达下调(P<0.05),AQP3在mRNA水平上与对照组相比出现明显上调(P<0.05),在蛋白水平上不存在着明显差异(P>0.05)。AQP8的mRNA和蛋白表达水平较正常组对比均没有明显的变化(P>0.05)。  2.病毒滴度测定的结果提示染料木素无抗RV吸附和入侵细胞的作用,但是其能有效的抑制RV在宿主细胞内的复制扩增,并且呈现出一定的剂量-效应和时间-效应关系。同时qRT-PCR及Western blot的结果提示染料木素能有效地抑制RVmRNA转录和病毒结构蛋白VP-6的合成。ELISA结果提示20μM剂量以上的染料木素能抑制胞内外RV抗原的释放。IFA的结果也表明了染料木素能抑制胞内RV病毒颗粒的释放。同时我们发现染料木素能上调在RV感染过程中低表达的AQP4,并且该效应也呈现出了一定的剂量-效应和时间-效应关系。  3.染料木素能刺激RV感染后的Caco-2细胞使得胞内AC活性较对照组相比增加1.38倍,PKA的活性较对照组相比增加了1.59倍;同时染料木素能促使RV感染的Caco-2细胞内CREB蛋白发生磷酸化,磷酸化后的CREB进一步促使胞内AQP4表达上调。  [结论]:  1.RV-Wa及SA-11病毒株感染Caco-2细胞均可下调胞内AQP4的表达。随着RV感染时间的增加,AQP4的表达水平逐渐下调。因此我们推测AQP4可为RV感染的作用靶点之一。  2.染料木素无抗RV吸附和入侵细胞的作用,但是能有效地抑制轮状病毒RNA的转录和RV结构蛋白VP-6的合成,从而抑制RV的在宿主细胞内的复制。同时染料木素在抑制病毒复制的过程中上调了RV感染过程中低表达的AQP4。  3.染料木素可通过调控cAMP/PKA/CREB信号通路上调RV感染Caco-2细胞胞内AQP4的表达。  4.染料木素抗RV的作用是通过其抑制病毒蛋白的转录、翻译和上调宿主细胞的AQP4的表达所调控的。
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