木棉花水提物急性毒性试验及其对免疫低下小鼠的影响

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目的:本实验通过通过最大给药量对木棉花水提物进行急性毒性试验,以确定木棉花水提物低、中、高剂量组的给药剂量。并通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,以木棉花水提物低、中、高剂量组灌胃给药2周,以香菇多糖片为阳性对照组,研究木棉花水提物对免疫低下小鼠免疫功能的影响。为木棉花水提物用于提高机体免疫功能方面的药物开发及后续研究提供安全性理论基础及实验依据。方法:1.急性毒性试验昆明小鼠共32只,雌雄各半,并随机分为两组,分别是空白组和给药组各16只。给药组小鼠每次按照0.4ml/10g体积和1.5g/ml的生药浓度,给予木棉花水提物最大给药量灌胃,每24小时对小鼠灌胃2次,每次尽量间隔时间尽量控制为12小时,一天内共给药剂量为120g/kg。空白组小鼠每次按照0.4ml/10g灌胃体积,给予生理盐水灌胃,灌胃的次数和给药组小鼠一样。2.木棉花水提物对免疫低下小鼠的影响2.1 112只昆明小鼠,体重18~22g,雌雄各半,按体重随机分为空白组、香菇菌多糖组(阳性对照组)、环磷酰胺组(模型组),木棉花水提物低、中、高剂量组,其中空白组和环磷酰胺组每组各24只小鼠,其余各组各16只。2.2除空白组外,其余每组分别于第1天、第4天、第7天,给小鼠腹腔各注射环磷酰胺一次,50mg/kg,容量为10ml/kg,造模。并于7天后每周给小鼠腹腔注射一次30mg/kg的环磷酰胺,使其维持免疫低下模型状态,制造免疫低下模型。并且在造模的第7天,分别各取8只空白组和环磷酰胺组小鼠,处死并解剖,对比其体重、脏器/体重比例来确定是否建模成功。2.3建立小鼠免疫低下模型,空白组和环磷酰胺组小鼠每天灌胃0.1ml/10g生理盐水,木棉花水提物低剂量组(1.5g/kg)、木棉花水提物中剂量组(3.0g/kg)、木棉花水提物高剂量组(6.0g/kg)等药物治疗组小鼠每次按相应浓度灌胃给予0.1ml/10g的药物,香菇多糖组按照0.2g/kg/d进行灌胃给药,每天一次,连续两周。2.4分别于造模前,第一次给药前和给药后给小鼠称重,其他时间段则每三天称重一次并做好记录,每三天再根据所测体重调整一次给药量。2.5各组再取8只小鼠,通过碳廓清实验对小鼠进行眼球取血,比较小鼠的单核-巨噬细胞数量,并通过称量免疫器官湿重和小鼠的体重,免疫器官湿重和小鼠体重的比值即为脏器指数,并比较实验小鼠肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数。2.6另各组取8只小鼠,通过足趾增厚法来检测试验小鼠的迟发型变态反应能力;并通过血清溶血素实验测定小鼠血清溶血素的含量;ELISA法测定免疫球蛋白A(Ig A)、免疫球蛋白G(Ig G)、免疫球蛋白M(Ig M)和白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、和γ-干扰素(IFN-γ)的含量;巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(滴片法)测定小鼠巨噬细胞的数量;流式细胞术检测脾脏T细胞数量。结果:1.急性毒性实验结果:小鼠观察指标等无明显异常。观察期间无小鼠死亡。给药期间,小鼠体重有轻微的波动,空白组合给药组小鼠的总体呈增长趋势。且通过统计学分析,提示差异并无统计学意义(P>0.05)。给药14天后,将空白组合给药的小鼠通过颈椎脱臼处死,并对小鼠进行大体解剖,通过肉眼观察到的小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺等重要脏器并无明显出血、充血、水肿等其他病理改变。说明给予小鼠灌胃最大剂量120g/kg的木棉花水提物无明显毒性。2.造模结果:与空白对照组比较,环磷酰胺组体重、胸腺指数明显降低(P<0.05),提示造模成功。3.免疫器官指数:肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数与环磷酰胺组对比,香菇多糖组、木棉花水提物低、中、高剂量组均有所降低(P<0.05)。4.碳廓清实验、迟发性变态反应实验、溶血素实验、巨噬细胞吞噬实验等结果:与环磷酰胺组比较,碳廓清实验和迟发性变态反应实验的木棉花水提物低、中、高剂量组的相关实验数据均无统计学意义(P>0.05);测定血清溶血素实验中,木棉花水提物中剂量组的血清溶血素水平升高(P<0.05);巨噬细胞吞噬实验中,木棉花水提物中、高剂量组吞噬指数和吞噬百分率显著升高(P<0.01)。5.通过ELISA法测定的小鼠血清的Ig A、lg G、lg M、IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子含量结果:与环磷酰胺组对比,木棉花水提物中、高剂量组的Ig G、IFN-γ的含量显著升高(P<0.01);木棉花水提物中、高剂量组的IL-2的含量升高(P<0.05);木棉花水提物低剂量组的IFN-γ的含量升高(P<0.05);木棉花水提物中剂量组的Ig A的含量升高(P<0.05);木棉花水提物高剂量组lg M的含量显著升高(P<0.01);木棉花水提物高剂量组IL-6的含量升高(P<0.05)。6.流式细胞术对T细胞亚群的影响:与环磷酰胺组对比木棉花水提物低、高剂量组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+细胞比例有所升高,但无统计学意义(P>0.05),而木棉花水提物低、中、高剂量组的CD8+细胞有所降低,但无统计学意义(P>0.05)。结论:1.急性毒性试验结果显示,木棉花水提物无明显毒性作用。2.通过腹腔注射环磷酰胺,建立小鼠免疫低下模型,造模后,通过观察,小鼠的体重降低,胸腺指数降低,提示造模成功。3.木棉花水提物能提高免疫低下小鼠的免疫力,其机制可能与增加免疫球蛋白的分泌和增强细胞的吞噬能力等有关。
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