辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)RxLR效应因子的克隆与功能研究

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辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)作为一种重要的土传病害,给辣椒造成的危害是毁灭性的,在辣椒上的发病症状主要是烂根、立枯、茎枯、果实腐烂等。目前,对于辣椒疫霉的防治主要是以化学防治为主,结合其他的农业防治措施,防治的成效比较低,防治工作进行的也比较缓慢,在气候适宜的年份,辣椒疫霉仍会大面积的发生。随着人们对于卵菌研究的不断深入,人们发现RxLR效应因子在植物病原卵菌与植物互作的过程中起到了重要的作用,因此,研究RxLR效应因子与寄主抗性的内在机制成为当下研究的热点。  辣椒疫霉作为植物病原卵菌的重要一员,特别适合用来研究卵菌,同时,在辣椒疫霉中也存在大量的RxLR效应因子,当前对于RxLR效应因子研究最多的是致病疫霉和大豆疫霉,RxLR效应因子的功能也呈现出了多样性的特点,所以我们认为对于辣椒疫霉RxLR效应因子的研究十分必要且有意义。我们利用先进的分子生物学技术对辣椒疫霉菌的RxLR效应因子进行功能研究,期望能够得到有意义的RxLR效应因子,未来对其进行深入研究,以期能够为辣椒疫霉的防治提供理论上和实践上的依据。  本研究以本实验室采集并分离保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料,从中选取克隆了三个RxLR效应因子,对辣椒疫霉菌株SD33中的RxLR效应因子进行了如下研究:  1、辣椒疫霉菌株SD33中RxLR基因的选择、基因克隆、生物信息学分析。根据本实验室对于辣椒疫霉RxLR基因的晶体学的研究,选取了3个RxLR基因,从辣椒疫霉菌基因组数据库中成功筛选并克隆得到了这3个 RxLR基因,分别为 RxLR129044、RxLR133393、RxLR116645。利用多种生物信息学分析软件对三个基因进行多种生物学信息的预测及分析。  2、RxLR129044、RxLR133393、RxLR116645基因在本氏烟上瞬时表达的检测。利用Western blot对于RxLR129044、RxLR133393、RxLR116645基因的正常表达进行了检测,检测发现RxLR133393、RxLR116645能够正常表达,RxLR129044需要去掉RxLR-dEER才能正常表达。  3、RxLR129044、RxLR133393、RxLR116645基因的亚细胞定位。为了进一步研究RxLR129044、RxLR133393、RxLR116645基因的功能,我们先对其在亚细胞中的定位进行了分析,研究发现RxLR129044没有明确定位;RxLR133393定位于细胞膜和细胞核;RxLR116645基因定位于细胞质。  4、对 RxLR129044、RxLR133393、RxLR116645基因的功能研究。我们对于三个基因的致病性、抑制细胞坏死的能力和对辣椒疫霉侵染的影响进行了分析,研究表明,RxLR116645能够引起本氏烟和辣椒的细胞死亡;RxLR129044、RxLR133393没有这方面的功能。  5、核定位和核输出信号对 RxLR116645功能的影响。将 RxLR116645分别加上了核定位信号NLS和核输出信号NES,并对其功能进行了再次研究,研究发现核定位信号使其功能丧失,核输出信号不改变其功能。  通过本项研究,我们可以推测 RxLR116645在辣椒疫霉菌与寄主植物互作的过程中发挥着一定的作用,农杆菌介导的瞬时表达技术在本研究中的成功应用,为RxLR效应因子的功能的快速研究提供了技术基础,本研究也为下一步的研究指明了方向,可以通过酵母双杂技术筛选到可以与RxLR116645互作的寄主体内的蛋白,进一步揭示其的致病机理。
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