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目的探讨分别单沉默和共沉默ERCC1和BRCA2基因后顺铂(DDP)对耐药肺腺癌细胞(A549/DDP)的细胞毒性变化及其可能的机制?方法运用细胞脂质体转染技术将靶向于ERCC1和BRCA2基因的siRNAs(ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA)分别和同时转染于体外培养的A549/DDP细胞。Western Blot检测该细胞转染前后ERCC1和BRCA2蛋白表达水平以确认转染成功。用不同浓度DDP处理A549/DDP细胞,测定ERCC1基因沉默前后FANCD2单泛素化水平(以FANCD2-L/S比值表示),以及BRCA2基因沉默前后BRCA1和RAD51蛋白的表达水平。同时测定DDP敏感肺腺癌细胞(A549细胞)经不同浓度的DDP诱导后FANCD2单泛素化、BRCA1和RAD51蛋白的表达水平。应用CCK-8法和Annexin V/PI流式细胞术分别测定ERCC1和BRCA2基因单沉默及共沉默前后经不同浓度DDP处理的A549/DDP细胞增殖率与凋亡率变化。免疫荧光染色法分别测定ERCC1基因沉默前后的FANCD2核聚小体表达及BRCA2基因沉默前后RAD51小体表达。结果(1)Western Blot结果显示,应用ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA分别转染A549/DDP细胞后ERCC1和BRCA2蛋白的表达水平均明显低于转染前(P均<0.05),表明ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA转染有效,ERCC1和BRCA2基因被沉默。(2)Western Blot和免疫荧光法结果显示,A549/DDP细胞的FANCD2单泛素化水平、BRCA1和RAD51蛋白的表达水平随着DDP浓度的增加总体上呈上升趋势,而A549细胞并未显示出这一趋势,提示范可尼贫血(FA)通路和同源重组修复(HRR)通路参与了A549/DDP细胞对DDP的耐药机制。ERCC1基因沉默后经DDP处理的FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体表达较沉默前均显著下降(P均<0.05);BRCA2基因沉默后经DDP处理的BRCA1和RAD51蛋白表达及RAD51核聚小体表达水平亦较沉默前显著下降(P均<0.05),表明FA通路和HRR通路DNA修复功能受到抑制。(3)CCK-8法和流式细胞术测定结果示,分别沉默ERCC1基因和BRCA2基因后均能增强DDP对A549/DDP细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用(P均<0.05),这两个基因共沉默较单基因沉默可进一步增强DDP对A549/DDP的细胞毒性作用(P均<0.05)?这一结果表明同时沉默ERCC1和BRCA2基因在增强DDP对耐药肺癌细胞的杀瘤效应方面具有协同作用。结论沉默ERCC1与BRCA2基因均可逆转耐药肺癌细胞A549/DDP对DDP的耐药性,且两个基因共沉默这种逆转DDP耐药的作用更明显。这种逆转耐药作用主要是通过抑制FA通路和HRR通路的DNA损伤修复功能功能来实现的。