随着现代社会物质生活水平的提高和生活模式的改变,世界范围肥胖人口的比例在快速升高。世界卫生组织(WHO)日前公布,截止到2013年,全世界有超过21亿人超重或肥胖,其中美国占全球肥胖者的13%,而我国和印度共同占总数的15%。肥胖及其引发的相关疾病也越来越受到公众和社会注意。以肥胖、高血脂、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等为组成的代谢综合征已成为首要危害人民健康的一组疾病。最早期相关血管功能的异常是内皮功能障碍,主要表现为血管对缩血管物质的反应性增加,对舒血管物质的反应性降低。内皮功能障碍的诱发因素主要包括肾素-血管紧张素系统过度激活、缺氧/复氧损伤、缺血/再灌注损伤、胰岛素抵抗、炎症/免疫反应、氧化应激和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)等。内质网是蛋白质合成、折叠和成熟的主要部位,其内环境的稳定是实现内质网功能的基本条件。ERS是指蛋白质折叠、捕获和降解的破坏,导致内质网中未折叠蛋白的积累。高脂可引发肥胖动物内质网中蛋白质合成速度过快以至于超过蛋白质折叠能力,导致未折叠和错误折叠蛋白的积累,表现ERS。而ERS又可激活炎症反应,促进肝脏和脂肪组织的胰岛素抵抗,引发血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化。自噬是一种溶酶体相关的降解蛋白质和回收细胞器的重要细胞过程,与ERS之间存在互为因果的功能性耦合。ERS作为自噬反应的刺激者,为细胞在不利环境下存活而激活自噬,去除功能失调或损坏的细胞器,减轻ERS以恢复内质网动态平衡,从而保护生命体。因此,自噬是蛋白质稳态和抗氧化应激的重要机制之一。自噬流指整个自噬的动态过程,是评价自噬功能的重要指标。自噬体的形成及其在溶酶体内的降解是自噬流的两大关键部分。自噬功能的缺损或障碍,会加重氧化应激和ERS,参与各种疾病的发生发展,包括脂质代谢异常、神经变性、肿瘤、衰老及缺血再灌注损伤等心脏相关疾病。高脂饮食喂养的动物,由于自噬流改变,导致外周组织对胰岛素信号转导障碍和ers,发展为肥胖。与之对应的是,肥胖动物的自噬功能障碍,表现为氧化应激、ers和no生物利用度受损,减弱内皮细胞抗动脉粥样硬化的保护功能。自噬接受众多分子信号途径调控,其中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemono-phosphateactivatedproteinkinase,ampk)既作为上游能量传感器,又作为下游自噬活化剂,特别是在糖尿病等内分泌紊乱疾病中发挥重要作用。ampk主要通过抑制mtor复合物和磷酸化ulk1,触发自噬两个下游信号分子s6k1和4e-bp1,以tsc1/2依赖性或非依赖性机制,在能量平衡和代谢应激中正向调节自噬。我室以往研究表明,慢性间歇性低压低氧(chronicintermittenthypobarichypoxia,cihh)对机体多种组织具有保护作用。在心脏方面,可促进缺血/再灌注心脏功能的恢复、缩小梗死面积和抗心律失常;在肝脏方面,可降低代谢综合征大鼠ers介导的肝脏损伤,改善胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱及肝组织脂肪样变;在血管方面,可通过上调肾血管性高血压大鼠血管enos表达,增加no产生,增强大鼠动脉内皮依赖性舒张,发挥抗高血压作用。此外,cihh还具有免疫调节、抗炎和抗氧化等有益作用。据此,我们提出假设:cihh可明显改善代谢综合征肥胖大鼠血管内皮功能障碍及血管舒缩功能紊乱,此作用可能通过增强自噬功能,降低ers,增加no产生所实现。本研究拟利用代谢综合征肥胖大鼠,应用形态学、生理学以及分子生物学等方法,从整体、组织和细胞不同水平明确cihh对代谢综合征肥胖大鼠肠系膜阻力血管内皮和血管舒缩的影响,并探讨其机制。本研究分为三部分:(1)通过形态学、生物化学和微血管张力测定等方法确定cihh对代谢综合征肥胖大鼠肠系膜动脉血管内皮和血管舒缩功能的保护作用。(2)通过离体血管培养、微血管张力测定和westernblot等方法探讨抗氧化应激和ers在cihh血管内皮保护中的作用。(3)通过离体器官培养、微血管张力测定和westernblot等方法探讨自噬在cihh血管内皮保护中的作用。第一部分慢性间歇性低压低氧对代谢综合征大鼠血管内皮和舒缩功能的保护作用目的:明确cihh对代谢综合征大鼠血管内皮和血管舒缩功能障碍的保护作用。方法:成年雄性sprague-dawlay大鼠随机分为四组:对照组(con)、慢性间歇性低压低氧处理组(cihh)、代谢综合征模型组(ms)、代谢综合征模型+慢性间歇性低压低氧处理组(ms+cihh)。con大鼠和cihh大鼠给予常规饲料和普通饮用水喂养。ms大鼠和ms+cihh大鼠给予高脂饲料加10%果糖水喂养诱导ms。16周后,cihh和ms+cihh大鼠接受相当于海拔5000m高度、28天、每天6小时的低压低氧处理,其余时间置于常氧环境。con和ms大鼠始终置于常氧环境。cihh处理期间,每周固定时间测定大鼠体重和动脉收缩压变化。28天cihh处理完毕后,测量大鼠身长、体重和体脂,计算lee’s指数和脂肪系数;扫描电镜下观察肠系膜血管周围脂肪细胞的大小;取静脉血测定血液生化指标(空腹葡萄糖、胰岛素、c肽、脂类)、炎症因子(白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α)、粘附分子(细胞间粘附分子-1和血管细胞粘附分子-1)、no和内皮素-1(et-1);利用微血管环张力测定法分别描记苯肾上腺素(pe)和去甲肾上腺素(ne)诱导的动脉环收缩反应,乙酰胆碱(ach)诱导的动脉环内皮依赖性舒张(edr)和硝普钠(snp)诱导的动脉环非内皮依赖性舒张。结果:1与con大鼠相比较,ms大鼠动脉收缩压和体重显著增加(p<0.05);cihh处理对正常大鼠基础动脉收缩压和体重无影响(p>0.05),但可显著对抗ms大鼠动脉收缩压的升高和体重的增加(p<0.05)。2与con大鼠相比较,ms大鼠lee’s指数、脂肪系数和肠系膜血管周围脂肪细胞直径明显增加;cihh处理对正常大鼠lee’s指数、脂肪系数和肠系膜血管周围脂肪细胞的大小无影响(p>0.05),但可显著对抗ms大鼠的肥胖表征和脂肪细胞增生(p<0.05-0.01)。3与con大鼠相比较,ms大鼠表现明显的糖、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗(p<0.05);cihh处理对正常大鼠代谢无明显影响(p>0.05),但可显著对抗ms大鼠的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗(p<0.05-0.01)。4与con大鼠相比较,ms大鼠表现炎症因子、粘附分子升高和no与et-1失衡(p<0.05-0.01);cihh处理对正常大鼠炎症因子、粘附分子和no与et-1平衡无影响(p>0.05),但可显著对抗ms大鼠的炎症因子、粘附分子升高和no与et-1失衡(p<0.05-0.01)。5与con大鼠相比较,ms大鼠肠系膜动脉环对pe和ne反应性明显升高,收缩增强(p<0.01);cihh处理降低大鼠肠系膜动脉环对pe和ne收缩反应性,减弱收缩(p<0.05-0.01),并对抗ms大鼠动脉环收缩的增强(p<0.01)。6与con大鼠相比较,ms大鼠肠系膜动脉edr显著降低(p<0.01);cihh处理明显增强肠系膜动脉edr(p<0.01),并对抗ms大鼠肠系膜动脉edr的降低(p<0.01)。7与con大鼠相比较,ms大鼠肠系膜动脉非内皮依赖性舒张明显降低(p<0.05);cihh处理可增加大鼠肠系膜动脉非内皮依赖性舒张(p<0.01),并对抗ms大鼠肠系膜动脉非内皮依赖性舒张的降低(p<0.01)。小结:本部分研究结果表明,高脂高果糖饮食诱导的肥胖ms大鼠存在明显的糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗,动脉收缩压升高,内皮功能损伤以及血管舒缩功能紊乱;cihh处理可能通过降低胰岛素抵抗,减轻炎症,增加no产生,从而减轻ms大鼠糖脂代谢紊乱、增强血管内皮功能和改善血管舒缩功能异常。第二部分慢性间歇性低压低氧通过抑制内质网应激改善代谢综合征大鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张目的:探讨氧化应激和内质网应激在cihh对代谢综合征大鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张改善中的作用及其机制。方法:成年雄性sprague-dawlay大鼠随机分为四组:对照组(con)、慢性间歇性低压低氧处理组(cihh)、代谢综合征模型组(ms)、代谢综合征模型+慢性间歇性低压低氧处理组(ms+cihh)。con大鼠和cihh大鼠给予常规饲料和普通饮用水喂养。ms大鼠和ms+cihh大鼠给予高脂饲料加10%果糖水喂养诱导ms。16周后,cihh和ms+cihh大鼠接受相当于海拔5000m高度、28天、每天6小时的低压低氧处理,其余时间置于常氧环境。con和ms大鼠始终置于常氧环境。应用微血管环张力测定法,观测no合酶抑制剂l-name、超氧阴离子清除剂4-hydroxy-tempo和ers抑制剂4-苯基丁酸(pba)对edr的影响;应用westernblot方法观测cihh对肠系膜动脉enos磷酸化蛋白表达,以及ers相关蛋白表达的影响;利用离体器官培养、微血管环张力测定法和westernblot方法,观察ers诱导剂衣霉素(tu)和抑制剂pba对cihh处理ms大鼠肠系膜动脉edr、enos磷酸化水平和ers相关蛋白表达的影响。结果:1与con大鼠相比较,l-name对ms大鼠动脉环edr抑制作用显著降低(p<0.01),对cihh大鼠动脉环edr抑制作用显著增强(p<0.01),可有效对抗ms大鼠对l-name抑制效应的降低(p<0.01)。2与con大鼠相比,4-hydroxy-tempo对ms大鼠动脉环edr的增强作用显著增加(p<0.01),对cihh大鼠动脉环edr的增强作用明显降低(p<0.01),可有效对抗ms大鼠对4-hydroxy-tempo增强作用的增加(p<0.05)。3与con大鼠相比,pba对ms大鼠动脉环edr的增强效应显著增加(p<0.01)。对cihh大鼠动脉环edr增强效应无显著性差异(p>0.05)。与ms大鼠相比较,pba对ms+cihh大鼠动脉环edr增强效应显著降低(p<0.01)。4与con大鼠相比较,ms大鼠肠系膜动脉enos(ser1177)磷酸化明显降低(p<0.01),cihh大鼠肠系膜动脉enos(ser1177)磷酸化无显著差异(p>0.05),但可有效对抗ms大鼠肠系膜动脉enos(ser1177)磷酸化的降低(p<0.01)。5与con大鼠相比较,ms大鼠肠系膜动脉ers相关蛋白grp78和chop表达明显上调(p<0.01),cihh大鼠肠系膜动脉grp78和chop表达无显著差异(p>0.05),但可有效对抗ms大鼠grp78和chop表达的上调(p<0.05-0.01)。6ers诱导剂tu可显著抑制ms+cihh大鼠动脉环ach诱发的edr(p<0.01),而ers抑制剂pba可显著增加ms+cihh动脉环ach诱发的edr(p<0.01)。7ers诱导剂tu显著增加ms+cihh大鼠动脉环grp78和chop蛋白表达(p<0.05-0.01),下调enos(ser1177)磷酸化(p<0.01);而ers抑制剂pba显著降低ms+cihh大鼠动脉环grp78和chop蛋白表达(p<0.05-0.01),上调enos(ser1177)磷酸化(p<0.01)。小结:本部分研究结果表明,高脂高果糖饮食诱导的肥胖ms大鼠肠系膜动脉存在明显的氧化应激和ers,通过降低enos磷酸化,导致no生成减少、血管舒张功能障碍;cihh可通过降低氧化应激和ers,增强enos磷酸化,增加no产生,从而改善内皮功能障碍和增强血管舒张功能。第三部分慢性间歇性低压低氧通过增强自噬改善代谢综合征大鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张目的:探讨自噬在cihh对代谢综合征大鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张改善中的作用及其机制。方法:成年雄性sprague-dawlay大鼠随机分为四组:对照组(con)、慢性间歇性低压低氧处理组(cihh)、代谢综合征模型组(ms)和代谢综合征模型+慢性间歇性低压低氧处理组(ms+cihh)。con和cihh大鼠给予常规饲料和普通饮用水喂养。ms大鼠和ms+cihh大鼠给予高脂饲料加10%果糖水喂养诱导ms。16周后,cihh大鼠和ms+cihh大鼠接受相当于海拔5000m高度、28天、每天6小时的低压低氧处理,其余时间置于常氧环境。con大鼠和ms大鼠始终置于常氧环境。利用westernblot方法,观察自噬相关蛋白、ampk磷酸化和mtor磷酸化;利用离体器官培养、微血管环张力测定法和westernblot方法,分别观察ers诱导剂tu和抑制剂pba、自噬诱导剂雷帕霉素(rapa)和抑制剂3甲基腺嘌呤(3ma)、ampkα抑制剂复合物c(comc)和mtor抑制剂rapa对大鼠肠系膜动脉edr及相应蛋白表达的影响;利用离体器官培养、透射电子显微镜和westernblot方法,检测自噬降解阻断剂氯喹(cq,即溶酶体抑制剂)对自噬流的影响。结果:1ers诱导剂tu显著增加ms+cihh动脉环自噬相关蛋白beclin-1和lc3-Ⅱ/Ⅰ的表达(p<0.01),而ers抑制剂pba显著降低beclin-1和lc3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达(p<0.05-0.01)。2自噬诱导剂rapa显著增加ms+cihh动脉环ach诱导的edr(p<0.01),而自噬抑制剂3ma显著抑制ms+cihh动脉环ach诱导的edr(p<0.01)。3自噬诱导剂rapa显著增加ms+cihh动脉环自噬相关蛋白beclin-1和lc3-Ⅱ/Ⅰ的表达(p<0.01),降低ers相关蛋白grp78和chop的表达(p<0.01),上调enos(ser1177)磷酸化(p<0.05);而自噬抑制剂3ma显著降低ms+cihh动脉环beclin-1和lc3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达(p<0.05),增加grp78和chop蛋白表达(p<0.05-0.01),下调enos(ser1177)磷酸化(p<0.01)。4与con大鼠相比较,ms大鼠肠系膜动脉自噬相关蛋白beclin-1、lc3-Ⅱ/Ⅰ和p62表达均明显上调(p<0.05-0.01)。与ms大鼠相比较,ms+cihh大鼠肠系膜动脉beclin-1、lc3-Ⅱ/Ⅰ和p62表达均明显降低(p<0.05)。5自噬降解阻断剂cq可增加各组大鼠肠系膜动脉自噬相关蛋白lc3-Ⅱ/Ⅰ和p62的表达,其中cihh大鼠蛋白升高最大(p<0.05-0.01),ms大鼠蛋白升高最小(p<0.05-0.01)。6与con大鼠相比较,ms大鼠肠系膜动脉ampk(thr172)磷酸化明显下调,mtor(ser2448)磷酸化明显上调(p<0.01)。与ms大鼠相比较,ms+cihh大鼠肠系膜动脉的ampk(thr172)磷酸化明显上调,mtor(ser2448)磷酸化明显下调(p<0.01)。7ampkα抑制剂comc可显著抑制ms+cihh大鼠肠系膜动脉的edr(p<0.01),而mtor抑制剂rapa可显著增加ms+cihh大鼠肠系膜动脉edr(p<0.01)。8ampkα抑制剂comc可显著降低ms+cihh大鼠肠系膜动脉的ampk(thr172)磷酸化(p<0.01),增加mtor(ser2448)磷酸化(p<0.01),降低beclin-1和lc3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达(p<0.05-0.01),升高grp78和chop蛋白表达(p<0.01),下调enos(ser1177)磷酸化(p<0.01);而mtor抑制剂rapa增加ms+cihh大鼠肠系膜动脉的ampk(thr172)磷酸化(p<0.01),降低mtor(ser2448)磷酸化(p<0.01),增加beclin-1和lc3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达(p<0.01),降低grp78和chop蛋白表达(p<0.05-0.01),上调enos(ser1177)磷酸化(p<0.01)。小结:本部分研究结果表明,高脂高果糖饮食诱导的肥胖ms大鼠肠系膜动脉ampk-mtor信号通路活性降低、自噬流降解途径障碍、ers介导的自噬相关蛋白表达增强、enos磷酸化下调、内皮功能受损和edr反应降低;cihh通过激活ms大鼠肠系膜动脉ampk-mtor信号通路,改善自噬流的功能,降低ERS,促进eNOS磷酸化,增加NO产生,从而保护血管内皮和增强EDR反应。结论:高脂高果糖饮食诱导的肥胖代谢综合征大鼠呈现明显的糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、炎症和氧化应激,肠系膜动脉ERS和自噬功能障碍、血管内皮功能损伤和舒缩功能紊乱。CIHH处理对代谢综合征大鼠肠系膜动脉具有明显的内皮保护和内皮依赖性舒张改善作用,此作用可能通过抗氧化应激、抑制ERS、改善自噬功能障碍、上调eNOS磷酸化和增加NO产生所实现。此外,CIHH处理对代谢综合征大鼠肠系膜动脉的保护作用可能也与CIHH改善糖脂代谢紊乱、降低胰岛素抵抗、减轻炎症有关。