生物催化(biocatalysis)是指利用酶、微生物细胞或者动植物细胞作为催化剂催化化学反应的过程。与化学催化剂相比,生物催化剂具有很多优点,如:反应条件温和、催化效率高、副产物少等。生物催化符合当今时代绿色发展的要求,将会具有更广阔的应用范围和更光明的发展前景。己二酸常用作合成尼龙6.6的中间体,是最重要的二元羧酸之一。据估计到2022年时,全球的己二酸市场将达到80亿磅,因此己二酸具有的商业价值不容小觑。目前生产己二酸普遍还是通过石油化工路线,如硝酸催化KA油(环己醇/环己酮混合物)的氧化进行化学合成,在合成过程中会产生大量的N2O,其造成的温室气候影响比CO2高298倍。己二酸生产造成的N2O排放占工业总N2O排放的80%左右,其工业减排潜力约占96.2%,使用绿色可再生原料生产己二酸可以有效地降低生产过程所带来的环境污染。由于没有可靠的天然的合成途径,需要以基因工程和代谢工程的手段整合外源基因从而构建生物法合成己二酸途径,但是到目前为止利用生物法合成己二酸在经济上看仍然是不可行的。对于构建热力学可行且经济可行的绿色生物己二酸途径还需要更多的努力。现已构建的己二酸生物合成途径大多数会涉及到烯己二酸的碳碳双键还原,故而烯键还原酶的催化活性是影响生物法合成己二酸工业化的重要因素。烯键还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)能催化共轭的C=C双键的立体选择性的加氢反应,产生含有多达两个新的手性中心的化合物,是生物催化合成的重要酶类之一。本课题研究对象为己二酸生物合成途径中所需的来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans的烯键还原酶(ER-BC),旨在通过定向进化提高其催化活性并深入研究其催化机理等酶学性质。(1)来源于凝结芽孢杆菌的烯键还原酶ER-BC没有己报道的晶体结构,不具备直接进行定点突变的条件,以易错PCR构建的随机突变文库为基础,经96孔板初筛及摇瓶发酵复筛,获得2株(分别命名为ER-BC-7、ER-BC-15)酶活明显提高(酶的比活力提高7倍)的 菌 株,其 中 ER-BC-7 具 有 四 个 突 变 位 点Leu181Pro/Ile187Asn/Phe207Tyr/Phe229Ile,ER-BC-15 具有两个突变位点 Gly 111 Asp/Gly531 Ser。(2)借助计算机辅助,使用穿线法——I-ATSSER预测服务器建模得到ER-BC结构。利用穿线法构建的ER-BC模型与底物2-烯-1,6-己二酸通过autodock4进行分子对接,对接结果显示底物与Va161、His71和Tyr180形成了氢键作用,配体FMN处在底物与活性位点的附近,但其与底物具有一定距离,Tyr180与底物的羧基O-能够形成氢键,为烯键还原酶ER-BC的定点突变奠定了实验基础。(3)综合文献所得信息及随机突变、同源建模结果,共设计21种突变体蛋白,最终得到酶活提高12倍的突变体蛋白G111D+L181P。综合以上实验结果提出了 ER-BC的催化机理:首先由辅酶FMN向底物的β-C传递第一个H+(限速步骤);随后180TYR为底物的α-C提供第二个H+,完成双键的还原,由任意残基与底物形成氢键以稳定结合。(4)对野生型烯键还原酶ER-BC及其酶活提高的的突变体蛋白的酶学性质如最适反应温度、最适反应pH、耐氧性及动力学参数进行了测定。测定结果显示突变体蛋白S109N+G111D+L181P与G111D+L181P的Km/Kcat与野生型ER-BC相比分别提高了 9倍、14倍。