研究背景和目的恶性肿瘤的发病率和死亡率呈逐年升高的趋势,因此新的安全有效且成本较低的抗肿瘤药物和治疗方法一直是医学界研究的热点。由于肿瘤血管生成对肿瘤的生长和转移具有重要的促进作用,靶向抑制肿瘤血管生成已经成为了肿瘤治疗的主要方法之一。然而在实际临床应用中却发现,各类抗肿瘤血管生成药物疗效有限,容易产生耐药性,而且具有不同程度的毒副作用和高昂的经济成本。目前越来越多的研究发现,内皮细胞代谢也是血管生成的关键,仅通过下调血管内皮细胞的各条代谢通路就可能有效抑制肿瘤血管生成。中医学认为瘀血是导致肿瘤发生和发展的主要病机之一,大量研究表明活血化瘀类中药具有抗肿瘤血管生成的作用,红花是其中的典型代表之一,但目前关于红花水煎剂或水提物抗肿瘤及其血管生成的作用研究较少,也未对实验使用的药物进行必要的质量控制。斑马鱼作为一种新的模式生物具有产卵量大、胚胎发育迅速且光学透明、与人类基因组高度同源等优点,因此尤其适用于中药抗血管生成方面的研究。转录组学技术的发展为中药作用机制的研究开辟了新的研究方向,其全面检测和综合分析的研究方式与中药多靶点、多层次的作用特点非常契合。本次实验使用经过超高效液相色谱法指纹图谱测定质量合格的红花水提物作为实验药物,使用斑马鱼胚胎作为实验动物,观察红花水提物对斑马鱼胚胎血管生成的影响,然后使用高通量m RNA测序和生物信息学分析技术研究其作用机制,并使用q PCR技术和PRM技术分别从转录组学和蛋白组学水平上对测序结果以及发现的作用机制进行验证。本次实验为中药红花抗肿瘤血管生成活性的研究提供斑马鱼胚胎血管生成情况的表型研究证据,并为中药红花抑制血管生成作用机制的研究提供一定的分子生物学研究基础,同时也为中药红花在肿瘤中医治疗中的应用提供一定的实验研究结果支持。研究方法1、采用传统的中药饮片煎煮方法和浓缩干燥的方法制备红花水提物,然后采用超高效液相色谱法测定其指纹图谱。2、在Tg（fl1a:EGFP）品系转基因斑马鱼胚胎血管发育的关键时期使用红花水提物对其进行干预,然后通过显微镜观察斑马鱼胚胎的血管发育情况。3、对经过红花水提物干预后的具有血管生成抑制表型的实验组斑马鱼胚胎及空白对照组胚胎进行高通量m RNA测序,全面检测红花水提物干预后斑马鱼胚胎蛋白编码基因的转录变化情况,并对测序结果进行生物信息学分析。4、选择斑马鱼胚胎脂肪酸β-氧化通路上编码关键催化酶的差异表达基因cpt1b,hadhaa和acaa2作为进一步实验的对象,使用q PCR技术测定其表达水平,从而在转录组学水平上对测序结果和发现的作用机制进行验证。5、使用PRM技术检测斑马鱼胚胎脂肪酸β-氧化通路上差异表达基因cpt1b和hadhaa编码的蛋白的表达情况,从而在蛋白组学水平上对测序结果和发现的作用机制进行进一步的验证。研究结果1、制得红花水提物粉末68.23克,出膏率为34.12%,水分含量≤5%。测得的红花水提物指纹图谱中出现了与所有标准对照品相对应的特征峰,且相似度均不低于0.95,表明制得的红花水提物的质量合格且稳定。2、经过红花水提物干预后的斑马鱼胚胎大体形态发育正常,但体节间血管发育不良,背部长轴血管未见发育,同时在200μg/ml的药物浓度和26小时的干预时间下红花水提物对斑马鱼胚胎无致畸或致死作用。3、相对于空白对照组,经过红花水提物干预后的具有血管生成抑制表型的实验组斑马鱼胚胎的差异表达基因中,发生上调的有888个,下调的有965个。生物信息学分析发现,红花水提物抑制斑马鱼胚胎血管生成最可能的作用机制是下调血管内皮细胞的脂肪酸β-氧化通路所致。4、qPCR实验证实,红花水提物能够下调斑马鱼胚胎脂肪酸β-氧化通路上编码关键催化酶的基因cpt1b和hadhaa的表达。5、PRM实验证实,红花水提物能够下调斑马鱼胚胎脂肪酸β-氧化通路上基因cpt1b和hadhaa编码的相关蛋白的表达。结论红花水提物能够显著抑制斑马鱼胚胎血管生成,能够下调斑马鱼胚胎基因cpt1b和hadhaa的表达,从而下调脂肪酸β-氧化通路。红花水提物抑制斑马鱼胚胎血管生成的作用机制可能是通过下调血管内皮细胞的脂肪酸β-氧化通路所致。