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第一部分兔骨髓间充质干细胞和髓核纤维环细胞的分离、培养和鉴定 目的： 初步探讨兔骨髓间充质干细胞及髓核纤维环细胞的分离、培养和鉴定的方法，为其成为理想的种子细胞提供进一步的支持。 方法： 取8～l2周新西兰大白兔4只，雌雄不拘，取其股骨骨髓，梯度离心法分离得到骨髓间充质干细胞，同时取胸腰段脊柱的髓核，用梯度离心法分离纤维环细胞；用15％的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液，于37℃、5％CO2、100％饱和湿度条件下培养；光镜观察纤维环细胞和骨髓间充质干细胞的生长情况，取原代纤维环细胞脊进行电镜观察；检测第3代的骨髓间充质干细胞CD29、CD34、CD44表面抗原。 结果： 光镜下观察BMSCs呈椭圆形，旋涡状排列排列稀疏欠规整，细胞贴壁后折光性较差；纤维环细胞呈圆形或椭圆形，胞体大，细胞增殖不明显。纤维环细胞电镜扫描大小约为20-30um，细胞膜表面分布大量糖原，细胞内存在大量的大小不一的囊泡。对骨髓间充质干细胞表面抗原的检测发现：细胞表达CD29、CD44阳性，CD34阴性。其中CD29的平均表达率为90.1%，CD34的平均表达率为4.9%，CD44的平均表达率为84.5%。 结论： 密度梯度离心法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞和纤维环细胞，经过细胞鉴定具有MSCs和AFs的一般生物学特性，为其成为理想的种子细胞提供了进一步的支持。 第二部分兔骨髓间充质干细胞和纤维环细胞接触性共培养的实验研究 目的： 初步探讨兔骨髓间充质干细胞和纤维环细胞接触性共培养对BMSCs细胞增殖及主要细胞外基质的影响。 方法： 分别培养兔BMSCs细胞与AFs细胞，将两种细胞按不同比例(1：2、1：1、2：1)共培养，利用离心管培养技术培养3周后取材，光镜下观察细胞的生长情况，并行HE染色；CCK-8法检测细胞增殖。甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色检测骨髓间充质干细胞的细胞表型的改变情况，通过实时荧光PCR进行Ⅱ型胶原相关基因表达的检测。 结果： 在体外培养3周后，细胞团体积达到最大，涂片染色显示共培养组细胞致密，CCK-8检测发现BMSCs细胞与AFs细胞1：1组细胞增殖明显高于其余各组，实时荧光PCR检测结果显示Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达增强。甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色BMSCs单独培养组呈阴性，共培养组呈阳性。 结论： 在三维培养条件下，BMSCs与AF细胞共培养能够促进BMSCs增殖，增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量，表现出类软骨细胞表型。 第三部分经皮纤维环穿刺法建立兔椎间盘退行性改变动物模型的实验研究 目的： 评估经皮纤维环穿刺法制备兔椎间盘退变动物模型的可行性。方法： 新西兰大白兔L2/L3、L3/L4椎间盘作为穿刺干预椎间盘，L1/L2、L5/L6椎间盘作为空白对照椎间盘，采用C形臂辅助下经皮穿刺法干预椎间盘。于术前及术后2、4、8、12周各选择2只实验动物麻醉后拍摄兔腰椎核磁共振影像，处死动物采集椎间盘，进行椎间盘髓核蛋白多糖测定。主要观察指标：核磁共振检查观察椎间盘退行性改变，DMMB染色分光光度法测定髓核中蛋白多糖含量变化。 结果： 手术干预椎间盘组织，髓核区域核磁信号强度逐渐下降，椎间盘高度下降，空白对照椎间盘信号强度基本保持一致。随着时间推移手术干预椎间盘髓核内蛋白多糖含量呈现逐渐下降趋势。 结论： C形臂X线机辅助下经皮纤维环穿刺法是一种动物创伤小、操作简便的椎间盘退变动物模型制备方法。 第四部分联合移植纤维环细胞和MSC阻止兔椎间盘退行性变的实验研究 目的： 使用纤维环穿刺抽吸法造模兔椎间盘退行性变，联合移植纤维环细胞(NC)及骨髓间充质干细胞(MSC)到退变的椎间盘内，观察退变椎间盘的变化。 方法： 取8～l2周新西兰大白兔12只，手术对兔脊柱L3-4、L4-5、L5-6、L6-7四个椎间盘行穿刺抽吸髓核组织造模，造模2周后取等比例共培养3天纤维环细胞和MSC移植到L4-5；单独的纤维环细胞移植到L5-6；单独的MSC移植到L6-7。动物饲养2周后处死行髓核组织的免疫组化及Western-blot检测椎间盘退变的改变情况。 结果： 穿刺抽吸髓核组织后2周行MRI检测兔椎间盘退行性变模型%ST2WI值较2周前相比明显下降，经过细胞移植后各组%ST2WI值均较对照组增高，尤其以联合细胞组为著。HE染色及甲苯胺蓝染色显示联合细胞移植后，椎间盘髓核内软骨样细胞明显增多，细胞外基质较各组丰富。Ⅱ胶原免疫组化：联合细胞移植组在髓核内较其它3组可见大片棕色区域，其间存在深染的棕黄色颗粒，基质内可见黄染阳性的软骨样细胞，靠近细胞处染色较深。通过Western-blot在蛋白水平检测后发现：对照组Ⅰ型胶原呈现高表达，分别是联合细胞移植组、单独移植纤维环细胞组、单独移植MSC组的24.78倍、13.63倍和14.03倍(p<0.05)。联合细胞移植组Ⅱ型胶原的表达较C组和D组增高(p<0.05)。 结论： 纤维环细胞和MSC共培养后联合移植可以阻逆兔椎间盘的退行性变，为组织工程治疗椎间盘退行性变提供新的思路。