结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全世界男性和女性中最普遍、最致命的肿瘤类型之一。几十年前结直肠癌还是发病率较低的恶性肿瘤。然而目前,它已成为发病率最高的消化道恶性肿瘤,并且约占西方国家癌症相关死亡原因10%。我国虽然是发展中国家,但大肠癌在我国情况也不容乐观。近年来结直肠癌的发病率及死亡率一直呈现增长趋势。在发达国家的结肠直肠癌发病率的“上升”,可以归因于日益老龄化的人口、不良的现代饮食习惯以及吸烟、低运动量和肥胖等危险因素的增加。尽管目前已经广泛采取了有效的预防筛查措施,以及近年来综合治疗方案的众多重大进展,结直肠癌仍是最威胁人类健康的恶性肿瘤之一。导致这种境况的重要原因之一就是耐药。尽管在细胞毒性和靶向治疗方面取得了进展,目前对治疗耐药性的长期管理,仍然是针对无法治愈的转移性癌症的最大挑战之一。因为耐药可使肿瘤积累了逃避各种治疗的手段,并最终导致死亡。同源盒（HOX）基因是胚胎形态发生和分化的重要调控因子,HOX基因家族在发育、分化、凋亡、血管生成、运动和受体信号传递等方面起着关键作用。也正因如此,这些基因表达的变化可能对肿瘤发生和肿瘤进展以及癌症诊断和治疗有重要影响。许多研究表明,不同的同源盒基因在某些器官中可差异性表现为有肿瘤抑制或肿瘤促进作用。就其致癌基因性质而言,同源盒基因通常在胚胎期表达,在肿瘤中重新激活,在正常分化的成人组织中被下调。相反,某些同源框基因在正常分化的成人组织中表达,但在肿瘤中被下调。有趣的是,同源框基因可能同时具有肿瘤促进和肿瘤抑制特性,这取决于表达的特定器官或细胞谱系。一些长或短的非编码RNA也参与调控同源框基因的转录或表达。因此,了解特定癌症类型或细胞谱系中同源盒基因的异常表达模式及其对某些类型癌症的致癌和侵袭机制非常重要。许多研究表明HOX基因表达有助于CRC的发展。HOXA10基因作为HOX家族的成员,也是胚胎形态发生和分化的调节因子,但在几种类型的癌症中都表现不明显。曾有报道HOXA10的解除管制与子宫内膜癌的进展有关,但同时HOXA10也可诱导乳腺癌细胞中p53的表达,降低其侵袭性。同时,HOXA10也是参与造血干细胞和祖细胞增殖的转录因子。它的过度表达与癌症的发展和急性髓系白血病和固体癌症患者的不良预后有关。这种同时具备的癌基因及抑癌基因的特性,在结直肠癌中,究竟表现为何种,目前仍是未知。HOXA10在结直肠癌的发生发展中究竟是否扮演了什么样的角色,目前尚不清楚。因此研究HOXA10在结直肠癌中的表达状态及功能机制,在临床中可能有着极为积极的意义。本研究通过探讨HOXA10蛋白在结直肠癌患者中的表达,试图阐明其临床意义,并解释其与结直肠癌预后、预测的关系。第一部分HOXA10蛋白表达与结直肠癌临床病理特征及预后的相关性目的:1.通过描述HOXA10在结直肠癌的表达状态,探讨其在结直肠癌发生中的作用意义。2.通过观察HOXA10和PTEN在结直肠癌表达状态的关系,解释HOXA10对结直肠癌预后的预测意义。方法:1.检索了来自Oncomine数据库关于HOXA10蛋白在结直肠癌表达的独立研究。2.随访2005年2月至2010年2月期间,在徐州市中心医院接受结直肠癌根治性切除,并术后接受含5-FU（5-氟尿嘧啶）或其衍生物的术后辅助化疗的CRC患者,随访终点为疾病进展。3.免疫组织化学检测癌和正常组织中HOXA10、PTEN的表达,分析HOXA10表达与结直肠癌5年DFS的相关性。结果:1.检索到Oncomine数据库的7项独立研究显示,与正常对照组相比,HOXA10在CRC组织中呈高度表达。2.总计完整随访了2005年2月至2010年2月期间,在徐州市中心医院接受结直肠癌根治性切除,并术后接受含5-FU（5-氟尿嘧啶）或其衍生物的术后辅助化疗的CRC患者85例。中位随访时间97月（6120月）,期间70例患者在术后5年内复发转移。3.免疫组化显示,有58例（68.2%）在肿瘤组织中显示了HOXA10蛋白的阳性表达,而在配对的癌旁正常组织中呈阴性表达。且HOXA10蛋白上调与PTEN下调同步。尽管与临床病理特征无关,但在HOXA10的上调与减少5年无病生存（DFS）之间存在显著相关性。Cox比例风险模型进一步揭示,除了淋巴结转移,HOXA10表达是CRC患者DFS预测的独立因素。结论:1.相对于正常组织,HOXA10蛋白在大多数结直肠癌中过度表达。2.HOXA10蛋白上调与PTEN下调同步,其上调与减少5年无病生存（DFS）相关。3.HOXA10在结肠癌中可能是一种潜在的生物标志物,其过度表达提示预后不良。4.HOXA10可能通过下调PTEN水平影响结直肠癌的预后。第二部分HOXA10基因在结直肠癌细胞中的功能研究目的:1.观察HOXA10基因敲降对结直肠癌细胞生物学行为的影响。2.观察HOXA10基因敲降对结直肠癌细胞5-FU化疗敏感性的影响。方法:1.用慢病毒介导的RNA干扰抑制Lo Vo和HT-29细胞株中的HOXA10表达,形成稳定低表达HOXA10的细胞株,并检测细胞的增殖、凋亡和集落形成变化。2.用5-FU梯度浓度干预上述细胞株,检测细胞的增殖变化。3.将各组细胞株种植于裸鼠右下肢成瘤,对比加用5-FU化疗与否对结直肠癌种植瘤的生长情况。结果:1.HOXA10敲除可降低HOXA10蛋白的表达。2.HOXA10敲除的Lo Vo和HT-29细胞生长明显受到抑制,凋亡增加,对5-FU的IC50值降低。3.HOXA10基因敲除可增强Lo Vo和HT-29细胞种植裸鼠对5-FU的化疗敏感性。结论:1.通过慢病毒介导的RNA干扰,成功构建HOXA10表达降低的Lo Vo和HT29细胞系。2.HOXA10基因敲除抑制结直肠癌细胞的增殖,增加其凋亡。3.HOXA10基因敲除增加了结直肠癌细胞株对5-FU的化疗敏感性。第三部分 miR-135a调控HOXA10影响5-Fu化疗敏感性的研究目的:1.寻找HOXA10的上游调控因子miRNA。2.验证上述miRNA功能,明确其作用机制。方法:1.通过生物信息学预测与HOXA10结合的miRNA,并通过Luciferase实验验证。2.通过化学合成上述鉴定过的miRNA,并转染Lo Vo和HT29细胞,并观察细胞增殖、凋亡及其对5-FU的IC50改变;3.Lo Vo和HT29细胞共转染miRNA mimics与HOXA10过表达载体,观察细胞增殖、凋亡及其对5-FU的IC50改变。结果:1.利用mi Rcode和Target Scan网站分析HOXA10的上游调控miRNA,初步筛选出mi R-135a和mi R-135b可与HOXA10非编码区互补结合。2.Luciferase实验证实HOXA10是mi R-135a和mi R-135b的作用靶点。3.Realtime PCR证实在结直肠癌Lo Vo和HT29细胞中,mi R-135a的表达均较HCo Epi C人结肠上皮细胞显著下调。4.转染了mi R-135a mimics的Lo Vo和HT29细胞,增殖受到抑制,凋亡增加,且对5-Fu的IC50降低。5.转染mi R-135a mimic作用后再使HOXA10过表达,可在一定程度逆转mi R-135a的作用。结论:1.mi R-135a是HOXA10的上游调节因子。2.mi R-135a过表达可抑制Lo Vo和HT29细胞的增殖、诱导其凋亡,且增加其对5-Fu的敏感性。3.mi R-135a可能通过抑制HOXA10过表达发挥作用。