研究背景瘢痕疙瘩是创口过度愈合导致的一种病理性纤维化形成,表现为超出创口边缘的持续性瘤样增生并侵犯邻近组织,常伴疼痛及瘙痒,不能自行退化。单纯手术切除后也极易复发,常造成外观畸形和功能障碍,严重影响患者身心健康与社会功能,是整形外科界长期以来的重大难题之一。尽管国内外众多学者进行了大量研究,但至今其病因及发病机制仍未完全明了。目前普遍认为瘢痕疙瘩处于相对缺氧的状态,而瘢痕疙瘩形成过程中炎症反应及高代谢状态又加剧了组织缺氧。因而推测缺氧在瘢痕疙瘩发生发展过程中起重要作用。缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是介导细胞缺氧应激反应与调节缺氧细胞生物学行为的核心因子,它是一种异源二聚体,主要由功能性亚基HIF-1α和结构性亚基HIF-1β两个亚单位组成。作为低氧应答的中枢性调控因子,HIF-1α表达严格地受氧浓度调节。在常氧条件下,HIF-1α蛋白可经泛素-蛋白酶解途径被迅速降解;而缺氧时则抑制其降解,使HIF-1α蛋白表达增加,并通过入核与靶基因特定DNA序列结合而激活靶基因表达,引起细胞对缺氧的一系列适应性反应。大量研究表明HIF-1α能够直接或间接地调节上百种缺氧适应性基因的表达,在肿瘤及血管生成、细胞能量代谢、创面愈合、炎症反应、纤维化疾病、肿瘤放化疗抵抗等方面发挥着重要作用目前国内外对瘢痕疙瘩中缺氧及HIF-1α诱导的信号通路机制的研究还很少。本课题根据瘢痕疙瘩的生物学特性与恶性肿瘤类似的特点,借鉴HIF-1α在肿瘤学、创面愈合及纤维化疾病领域的研究成果;结合我们前期研究结果:人瘢痕疙瘩组织中HIF-1α及TLR4表达水平显著高于正常瘢痕,HIF激动剂去铁胺(DFO)能诱导大鼠皮肤出现与瘢痕疙瘩类似病理性修复,主要表现为成纤维细胞过度增殖。在此研究基础上本论文进一步深入研究,从分子水平检测缺氧条件下HIF-1α与瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学改变的关联,明确HIF-1α及其调控的复杂网络缺氧信号通路在瘢痕疙瘩形成中的作用和机制,并在动物模型上证明HIF-1α抑制剂可以明显减少瘢痕疙瘩的生长,为瘢痕疙瘩临床防治及HIF-1靶向新药研发提供依据。研究目的1.比较瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织中HIF-1α的表达定位及表达差异情况。2.比较体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤组织中成纤维细胞HIF-1α的表达定位及表达差异情况。3.明确缺氧条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞HIF-1α的表达情况及其调控的缺氧通路对其细胞增殖、周期及凋亡的影响;明确HIF-1α对瘢痕疙瘩的过度生长特性有着重要的调控作用。4.明确HIF-1α在瘢痕疙瘩成纤维细胞中调控的缺氧通路包括TGF-β/Smαds通路、TLR4/MyD88/NFκB通路、ERK通路之间存在的相互作用关系并促进瘢痕疙瘩的形成发展。5.动物裸鼠移植瘢痕疙瘩模型证明HIF-1α抑制剂(2-甲氧基雌二醇,2-ME2)减少瘢痕疙瘩组织。研究方法1.第一部分通过RT-PCR、Western Blot及免疫组化检测瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织中HIF-1α的表达差异;体外培养人瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞,RT-PCR和Western Blot检测瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)与正常皮肤组织成纤维细胞(NFs)中HIF-1α的表达差异。使用1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气混合气体作为培养细胞供应气体,构建缺氧模型,通过Western Blot、免疫荧光检测缺氧与常氧条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞的HIF-1α的表达差异。2.第二部分利用RNA干扰技术沉默HIF-1α的表达,不同条件处理细胞后将瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)分为常氧组,缺氧组,con-siRNA组(缺氧Control siRNA对照组),HIF-1α-siRNA组(缺氧HIF-1α siRNA沉默组),分别通过CCK8试验、流式细胞仪检测上述四组细胞的增殖、周期及凋亡情况。3.第三部分通过Western Blot分别检测常氧组,缺氧组,con-siRNA组(缺氧 Control siRNA 对照组),HIF-1α-siRNA 组(缺氧 HIF-1α siRNA 沉默组)瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)中的HIF-1α、TGF-β/Smad信号通路、TLR-MyD88-NF-κB通路及ERK1/2通路的相关蛋白的表达差异,并通过Elisa检测上述四组细胞上清液中TGF-β1、CTGF、VEGF、IL-6及IL-8的表达差异;然后用NF-κB抑制剂处理KFs细胞后再次检测相关信号通路蛋白的变化。4.第四部分BALB/C裸鼠移植瘢痕疙瘩组织模型造模成功后,予以连续腹腔注射HIF-1α抑制剂(2-甲氧基雌二醇,2-ME2)21天,大体观察比较瘢痕疙瘩的形态大小及相关组织学分析。研究结果1.第一部分瘢痕疙瘩组织中HIF-1α广泛分布在其真皮层以及表皮基底层和少量棘层细胞中,主要环绕细胞核存在于细胞质中,而正常皮肤成纤维细胞中几乎观察不到HIF-1α的存在。瘢痕疙瘩组织及KFs中HIF-1α在转录水平和蛋白水平均高于正常皮肤组织及NFs,P<0.05;常氧条件下KFs中HIF-1α表达极低,仅见少量分布于细胞浆,而在缺氧条件下KFs表达HIF-1α蛋白水平显著增高,在细胞核与细胞浆中均明显表达增多。2.第二部分KFs在缺氧条件下表达HIF-1α的水平显著高于常氧组;缺氧组KFs较常氧组细胞增殖速度明显加快、G1期细胞百分比相似、凋亡细胞百分比相似;HIF-1α-siRNA转染KFs细胞后,而缺氧组KFs细胞HIF-1α表达降低,其增殖速度随之减慢、G1期细胞百分比显著升高,凋亡细胞百分比较也显著升高;而con siRNA组较缺氧组在细胞增殖、周期及凋亡均相似,无显著性差异。3.第三部分缺氧组 KFs 中表达 TGF-βIIR、TLR-4、MyD88 及 p-Smad2/3、NF-κB、ERK1/2 的水平及该组细胞上清液中 TGF-β1、CTGF、VEGF、IL-6、IL-8的含量均明显高于常氧组,P<0.05;而当HIF-1α基因表达被干扰后,缺氧租KFs细胞中上述蛋白的表达又明显降低,P<0.05;consiRNA组上述蛋白的表达与缺氧组无明显差异。另外,当使用NF-κB抑制剂处理KFs细胞后我们发现不仅TLR4/Myd88/NF-KB通路被抑制,TGF-β/smad通路也随之被抑制,其下游分子TGF-β、CTGF,VEGF的表达均降低。4.第四部分HIF-1α抑制剂在活体裸鼠体内对瘢痕疙瘩具有一定的抑制作用。瘢痕疙瘩组织移植于裸鼠肩胛区皮下21天后予以HIF-1α抑制剂腹腔注射干预3周后可见瘢痕疙瘩体积明显少于溶剂对照组及空白对照组,其主要抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长,Masson染色显示HIF-1α抑制剂组瘢痕疙瘩组织染色明显少于溶剂对照组及空白对照组。结论1.瘢痕疙瘩组织及其成纤维细胞表达HIF-1α水平均高于正常皮肤组织及成纤维细胞。缺氧条件下KFs表达HIF-1α蛋白水平显著高于常氧。2.缺氧条件下HIF-1α表达增高能明显促进KFs细胞的增殖活力,减少细胞凋亡水平。3.缺氧条件下HIF-1α可以:1.激活TGF-β/Smad信号通路促进下游TGF-β、CTGF和VEGF的表达;2.激活TLR4-MyD88-NF-κB信号通路促进下游IL-6的表达;3.激活ERK1/2促进下游IL-8的表达,进而促进瘢痕疙瘩形成。另外,在KFs细胞中HIF-1α诱导的TLR4-MyD88-NF-Kb通路可能与TGF-β/Smad通路有着crosstalk 作用。4.HIF-1α抑制剂(2-ME2)裸鼠腹腔注射21天后,其皮下移植的瘢痕疙瘩组织体积明显减小,胶原纤维较为疏松。