血虚证是临床常见证,多由生血乏源、失血过多、肾精亏损、大病久治不愈等引起。四物汤由熟地、当归、白芍和川芎组成,是经典的补血方剂,在临床上广为应用,但四物汤的作用机理和物质基础尚未完全阐明。本研究通过整体实验和细胞实验分别研究了辐射对小鼠骨髓细胞蛋白质表达的影响;四物汤及活性单体对辐射所致血虚证小鼠的补血作用;四物汤、芍药苷和川芎嗪对辐射所致血虚证小鼠骨髓细胞蛋白质表达及造血相关细胞因子 mRNA 表达的影响;四物汤、芍药苷和川芎嗪对人骨髓基质细胞细胞周期和蛋白质表达的影响,旨在为阐明辐射损伤骨髓造血功能的分子机理和四物汤与其活性单体补血作用及分子机理提供依据。本论文的主要研究内容和结果如下: 1. 四物汤及其活性单体对辐射所致血虚证小鼠补血作用的研究 采用 3.5 Gy 60Co γ 射线一次全身照射制备小鼠血虚证模型,利用外周血象测定、骨髓集落细胞培养等方法研究了四物汤、芍药苷、川芎嗪、阿魏酸和果糖对辐射所致血虚证小鼠的作用。研究结果显示: (1)3.5Gy 60Co γ 射线照射后,C57BL/6J 小鼠外周血白细胞计数显著下降,体外培养 CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-mix 集落数显著降低,胸腺指数和脾指数显著降低。提示,辐射后,小鼠的骨髓造血功能受到抑制,免疫器官及免疫功能受损。 (2)四物汤及其有效单体芍药苷、川芎嗪、阿魏酸及果糖均能促进辐射损伤所致血虚证小鼠外周血白细胞数量和骨髓造血祖细胞集落数的回升,以四物汤全方作用最为持久,四物汤和果糖作用最显著,芍药苷次之。 (3)果糖和川芎嗪分别能显著促进辐射所致显著萎缩的小鼠胸腺和脾脏这两个免疫器官的恢复,四物汤对两者均有促进恢复作用。提示:四物汤及其活性单体对辐射所致血虚证小鼠具有补血和促进免疫器官重量恢复的作用;四物汤中发挥补血作用的有效成分主要是果糖和芍药苷,改善免疫功能的有效成分主要是果糖和川芎嗪。 2. 辐射对小鼠骨髓细胞蛋白质表达的影响和四物汤及其活性单体对其表达变化的调节作用 本实验利用双向电泳、凝胶染色、图像分析、胶内酶切、质谱鉴定、数据库查询等蛋白质组学技术,研究了辐射对小鼠骨髓细胞蛋白质表达的影响以及四物汤、芍药苷和川芎嗪对辐射所致血虚证小鼠蛋白质表达的影响。实验结果显示: (1)辐射使小鼠骨髓细胞多种蛋白质的表达发生变化,主要作用体现在五方面:①直接或间接作用于造血生长因子信号途径的信号分子。辐射抑制小鼠骨髓细胞 Ras2 用蛋白质组学技术探讨四物汤补血作用机理的实验研究蛋白,ras mRNA 和丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK) mRNA 表达;抑制淋巴细胞特异性蛋白质 1(LSP1)表达;使生长因子受体结合蛋白 14(Grb14)、造血细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(HCP)表达上调。从而抑制造血生长因子信号途径,抑制骨髓细胞的生长、增殖;②作用于细胞周期蛋白。上调 Lgals12 表达,使骨髓细胞周期阻滞;③作用于调节转录的蛋白质。辐射抑制蛋白酶体 26S ATP 酶亚组分 4 表达,使组蛋白脱乙酰酶 3(HDAC3)表达显著升高,抑制骨髓细胞的基因转录。此外,辐射还抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶,抑制骨髓细胞糖的氧化分解和能量代谢。 (2)四物汤、芍药苷和川芎嗪可作用于辐射所致血虚证小鼠骨髓细胞的多个靶点,作用于多种蛋白质,在不同程度上逆转辐射对小鼠骨髓细胞蛋白质表达的影响。四物汤、芍药苷和川芎嗪可使辐射所致血虚证小鼠骨髓细胞 LSP1、蛋白酶体 26S ATP 酶亚组分 4、Ras 蛋白和 3-磷酸甘油醛脱氢酶回升,四物汤使 HCP、免疫球蛋白重链 VDJ区、Krox-6.1A 蛋白、Grb14、RIKEN cDNA 1700049E17 和 Lgals12 回落,芍药苷可使 HCP、HDAC3、Krox-6.1A 蛋白、Grb14 回落;川芎嗪可使 2300003P22Rik 蛋白、Ym1、免疫球蛋白重链 V 区和 Krox-6.1A 蛋白回落。本实验结果显示,四物汤的作用靶点最多,作用最广泛,包含了芍药苷和川芎嗪的主要靶点;与川芎嗪相比,芍药苷作用的显著特点是能使抑制基因转录的 HDAC3 和抑制生长因子信号途径及骨髓造血细胞增殖分化的 Grb14 和 HCP 的表达减少,推测这可能是芍药苷生血作用比川芎嗪更显著的机理之一。 (3)辐射能影响骨髓细胞中与造血生长因子信号途径相关的多种蛋白质的表达,四物汤及其活性单体能在不同程度上逆转这种变化是本实验的重要结果。 3. 四物汤及其活性单体对辐射所致血虚证小鼠骨髓细胞造血相关细胞因子基因表达的影响采用 3.5Gy 60Co γ 射线制备小鼠血虚证模型,提取骨髓细胞 RNA, 用 RT-PCR 方法研究了四物汤、芍药苷和川芎嗪对辐射所致血虚证小鼠骨髓细胞造血相关基因表达的影响。结果显示: (1)四物汤及其活性单体芍药苷、川芎嗪能影响辐射所致血虚证小鼠骨髓细胞多种细胞因子基因的表达,调节信号转导和细胞因子网络。表现在:①促进 Epo 和 G-CSF基因的表达;②促进核转录因子 NF-κB 基因表达;③使 IL-4R、IL-6、IL-7R、IL-18基因表达上调;④下调造血负调控因子TGF-β1基因的表达;⑤上调细胞信号分子ras、MAPKK 及 NF-κB 基因表达。提示四物汤、芍药苷和川芎嗪能促进骨髓造血细胞的发育、增殖、分化和成熟,提高免疫功能,促进放射性骨髓损?