背景:急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种严重的呼吸系统疾病,可引起严重的肺部炎症,破坏肺泡毛细血管膜细胞,并导致严重的急性呼吸衰竭,具有极高的死亡率。最新爆发的新型冠状病毒肺炎也属于一种病毒感染诱发的急性肺损伤。目前在临床上还未存在有特异性的分子标志物,这为其诊断和治疗提供了一定的难度。治疗上通常采用机械通气的方法,但只是支持性的治疗,且容易引起如气压伤、循环紊乱等医源性的并发症,治疗的重点还是要针对疾病的根本原因。目前还未有效果显著的药物应用于临床,对于急性肺损伤的药物研究也成为热点,但诸如糖皮质激素、沙丁胺醇等药物的应用并不能得到临床实验的支持,且存在一定的毒副作用,因此寻找有效的、经济的且毒副作用小的治疗急性ALI/ARDS的药物迫在眉睫。当ARDS发生时,肺部往往表现出强烈的炎症反应,并伴有大量的炎性细胞浸润,导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)、IL-6等促炎因子的释放。脂多糖(LPS)是已知的诱发各种器官,如肠、神经和乳腺等产生炎症反应的刺激物。目前,通过LPS刺激产生气道炎症来建立ALI动物模型的技术已被研究者普遍接受。以前的研究表明脂多糖刺激肺组织后促进大量炎症细胞和中性粒细胞的浸润,释放相关促炎介质,影响多种炎症通路。氧化还原体内平衡是由氧化剂和自由基平衡来维持的,特别是活性氧(ROS)和内源性抗氧化系统的清除能力。然而,接触有害刺激后,过多活性氧的产生可能会削弱细胞的抗氧化能力,对包括DNA、脂质和蛋白质在内的细胞成分产生毒性,加剧了氧化负担进而导致氧化应激。越来越多的证据表明氧化应激参与多种疾病的发病机制,如动脉粥样硬化、糖尿病、癌变,气道紊乱。潜在的抗氧化途径可以被内源性或外源性化合物调节,可能成为解决ALI的治疗目标。香兰素是一种天然产物,在自然界中广泛存在,常在香英兰豆、香茅,丁香花蕾、甜菜根、苏合香脂等一些天然物质中存在,常用于香料、化妆品或食物的香精中。人类用香英兰豆来获取天然香兰素的历史接近500年。我们惊喜地发现相关研究表明香兰素具有抗炎、抗氧化、抗诱变及抗肿瘤的药理作用,这为我们研制ALI/ARDS的临床药物提供了突破口。因此我们选用香兰素为研究对象,从炎症反应和氧化应激两个方面入手,探究其对急性肺损伤发挥预保护作用的分子机制。我们将从体内及体外实验探究在急性肺损伤过程中香兰素对ERK、p38、AKT及NF-κB的调节方式极其与炎性因子的关系。以支气管上皮细胞为对象模拟急性肺损伤时对细胞造成的氧化损伤,验证香兰对氧化因子及ROS调节的具体分子机制,为香兰素应用于ALI/ARDS的治疗提供科学依据,方法与内容:1.香兰素在急性肺损伤中发挥抗炎作用的研究(1)构建急性肺损伤动物模型,使用HE染色评估小鼠肺组织的损伤程度;MPO检测中性粒细胞浸润程度,使用ELISA方法评估炎性因子IL-6,IL-1β,TNF-α的蛋白表达水平;western blot方法检测ERK、p38、AKT及NF-κB的蛋白水平的表达。(2)体外实验验证香兰素发挥预保护作用的分子机制。CCK8实验选取合适的细胞给药浓度,ELISA方法评估炎性因子IL-6,TNF-α的蛋白表达水平;western blot方法检测ERK、p38、AKT及NF-κB的蛋白水平的表达。2.香兰素在急性肺损伤中发挥抗氧化作用的研究(1)在体外实验中ELISA方法检测小鼠肺组织的总抗氧化能力FRAP,ROS,SOD,GSH,CAT和MDA的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测相关细胞保护基因HO-1,GCLM,GCLC和NQO1基因水平的表达,western blot方法检测Nrf2,N-Nrf2,p AMPK,H3K9/14,HO-1蛋白水平的表达。(2)体内实验:CCK8实验方法选择香兰素预保护支气管上皮细胞的最适浓度;细胞免疫荧光实验分析香兰素对Nrf2入核情况及核内H3K9/14乙酰化水平的影响;之后western blot方法检测香兰素对支气管上皮细胞内Nrf2,N-Nrf2,p-AMPK蛋白水平表达的影响;实时荧光定量PCR检测相关氧化酶HO-1,GCLM,GCLC和NQO1基因水平的表达;双荧光素酶报告基因检测NRF2与ARE启动子的结合情况;实时荧光定量PCR检测相关氧化酶HO-1,GCLM,GCLC和NQO1基因水平的表达;使用AMPK通路阻滞剂CC后western blot方法检测Nrf2,N-Nrf2,p-AMPK蛋白水平的表达;使用组蛋白乙酰化酶抑制剂AA后实时荧光定量PCR检测相关氧化酶HO-1,GCLM,GCLC和NQO1基因水平的表达;模拟急性肺损伤的环境,使用CCK8的实验方法测量细胞活性选取最合适的刺激物配比;使用Nrf2抑制剂后使用ELISA方法检测小鼠肺组织的总抗氧化能力FRAP,ROS,SOD,GSH,CAT和MDA的蛋白表达水平;western blot方法检测Nrf2,p-AMPK,H3K9/14蛋白水平的表达;实时荧光定量PCR检测相关氧化酶HO-1,GCLM,GCLC和NQO1基因水平的表达。结果:1.成功构建小鼠ALI模型,香兰素可以抑制LPS诱导产生的急性肺损伤的肺组织损伤程度;相比于LPS组,香兰素+LPS组的MPO水平明显降低,IL-6,IL-1β,TNF-α的蛋白表达水平也显著降低;香兰素能够上调小鼠肺组织ERK、p38、AKT及NF-κB的蛋白水平。2.香兰素能够使巨噬细胞分泌的炎性因子IL-6,TNF-α表达下调,促进巨噬细胞内ERK、p38、AKT及NF-κB的蛋白表达。3.相比于LPS组,香兰素+LPS组小鼠肺组织内的总抗氧化能力FRAP,SOD,GSH和CAT的蛋白表达水平明显增高,ROS及MDA的表达水平降低,相关细胞保护基因HO-1,GCLM,GCLC和NQO1的转录水平增高,Nrf2,N-Nrf2,p-AMPK,H3K9/14,HO-1的蛋白表达水平增高。4.香兰素能够增加支气管上皮细胞内Nrf2的核积累及H3K9/14的乙酰化水平,且随时间的延长增多;香兰素能够促进支气管上皮细胞内Nrf2,N-Nrf2,p-AMPK蛋白水平表达,并促进Nrf2与ARE启动子的结合,进而提高下游细胞保护基因HO-1,GCLM,GCLC和NQO1的转录水平;使用AMPK抑制剂后,香兰素对p-AMPK及Nrf2、N-Nrf2的上调受到抑制;使用组蛋白乙酰化酶抑制剂AA后,香兰素对HO-1,GCLM,GCLC和NQO1转录水平的上调受到抑制;相比于氧化损伤组细胞,加入香兰素再刺激细胞损伤后细胞的总抗氧化能力FRAP,SOD,GSH和CAT的蛋白表达水平明显增高,ROS及MDA的表达水平降低,Nrf2抑制剂组则削弱了香兰素对FRAP,SOD,GSH,CAT,ROS及MDA的影响;对比与氧化损伤的细胞,加入香兰素后支气管上皮细胞内HO-1,GCLM,GCLC和NQO1的转录水平增高,Nrf2,N-Nrf2,p-AMPK,乙酰化H3K9/14,HO-1的蛋白表达水平增高。结论:1.香兰素能够对急性肺损伤发挥预保护作用,且通过对ERK、p38、AKT及NF-κB的调节来降低炎症因子的蛋白表达水平,从而减轻炎症。2.香兰素能够增强肺组织及细胞的总抗氧化能力,增强相关抗氧化酶的表达,上调相关细胞保护基因的转录水平进而发挥其抗氧化作用。3.香兰素是通过AMPK通路来激活Nrf2的,同时促进Nrf2核积累以及核内H3K9/14乙酰化,增加Nrf2与其下游ARE启动子的结合从而增高相关细胞保护基因的转录水平,并最终增强相关抗氧化酶的蛋白表达,减少ROS的分泌发挥其抗氧化作用。综上所述,我们的实验结果证实了香兰素对急性肺损伤的预保护作用,其发挥作用的途径是抗炎和抗氧化两个方面,炎症反应与氧化应激的相互作用仍需要进一步探讨。炎症反应和氧化应激作为急性肺损伤的两个重要机制,可能成为治疗ALI/ARDS药物研究的新方向,同时我们为香兰素作为ALI临床治疗的候选提供了科学的理论依据。