细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种常见方式,参与生物生命周期的大多数生理生化过程;同时也是生物生殖系统发育所必需的生理过程。细胞凋亡具有相对保守的形态变化特征包括:细胞质浓缩、染色体DNA断裂、细胞核裂解以及细胞骨架降解等。昆虫中细胞凋亡的研究主要集中于其生殖系统。昆虫卵发育后期,卵巢管滋养细胞中的营养物质以及染色体通过细胞凋亡的方式提供给卵细胞,从而保证卵细胞的快速正常发育。因此,大量滋养细胞群的凋亡又被认为是昆虫卵发育成熟的标志。微生物Wolbachia是一种母系遗传的细胞内共生菌,广泛存在于节肢动物中。由于共生茵Wolbachia的存活和繁殖都依靠寄主,其与寄主有着极为密切的关系。这类共生菌能对寄主生物学特性包括生殖等产生多方面的影响,但其是寄主的初级共生菌还是次级共生菌,因寄主以及Wolbachia株系不同而不同。目前关于共生菌Wolbachia调控寄主适合度的研究不少,但是相关机制并不了解。而对于共生茵Wolbachia调控寄主卵形成相关分子机制以及寄主自身生殖系统细胞生理生化变化的研究则更少。自然界灰飞虱都100%感染共生菌WolbachiawStri株系,并且共生菌可以通过灰飞虱雌成虫由卵垂直传播给后代,后代全部感染Wolbachia。灰飞虱雌成虫羽化后,Wolbochia大量聚集于其生殖器官卵巢。然而,共生菌Wolbachia是否对灰飞虱雌成虫生殖产生影响以及其对寄主卵的形成、发育以及相关调控机制并不清楚。由于卵巢是其灰飞虱繁殖后代以及共生菌Wolbachia垂直传播的重要器官,因此本研究以灰飞虱卵巢为对象,以期探究共生茵Wolbachia对寄主灰飞虱生殖调控的分子机制。本研究运用 FISH、RT-qPCR、TUNEL、RACE等生物学技术分析共生菌Wobachia对灰飞虱的生殖调控作用,并对其调控寄主卵发育过程中细胞凋亡关键因子进行深入研究。同时,运用免疫组化以及RNAi干扰等方法,对灰飞虱不同发育阶段卵巢中Folfbachiifa的分布进行定位并明确影响共生菌Wolbachia进入灰飞虱卵巢的关键因子。综合观察结果,提出共生茵Wolbachia进入昆虫端滋型卵巢的模型。取得如下结果:1.Wolbachia对灰飞虱适合度的影响对感染以及不感染Wolbachia的灰飞虱生物学特性进行比对分析发现,感染共生茵Wolbachia的灰飞虱产卵量显著高于不感染灰飞虱。感染Wolbachia的灰飞虱平均每只雌成虫产卵量为137±7(粒)(平均值±标准误),而不感染的灰飞虱平均每只雌成虫产卵量为103±5(粒),两者之间具有显著性差异。对于成熟后代比例分析发现,平均每只感染Wolbachia的灰飞虱后代发育至成虫的比例(70±3只)显著高于不感染Wolbachia的灰飞虱(58±3只)。然而,共生菌Wolbac/hia对灰飞虱发育历期、卵孵化率、雌成虫寿命以及后代雌性比例并没有显著性影响。2.Wolbachia对灰飞虱卵巢细胞凋亡的影响运用FISH原位杂交以及TUNEL免疫荧光技术,对感染以及不感染Wolbachia灰飞虱卵巢细胞凋亡情况进行检测。感染Wolbachia的灰飞虱羽化后第4天卵巢内出现细胞凋亡的现象,并且带有细胞凋亡卵巢管数高于不感染灰飞虱。感染Wolbachia灰飞虱中有11.8%的卵巢管出现细胞凋亡,而不感染Wolbachia灰飞虱只有7.5%的卵巢管出现细胞凋亡。感染以及不感染Wolbachia灰飞虱羽化后第10天的卵巢出现相似的情况,感染Wolbachia灰飞虱带有细胞凋亡的卵巢数量高于不感染灰飞虱。对灰飞虱羽化后第4天以及第10天卵巢中caspase-3-like蛋白酶活性以及表达水平测定结果再次表明,感染Wolbachia灰飞虱卵巢中细胞凋亡数高于不感染灰飞虱。3.抑制剂对灰飞虱细胞凋亡的影响对感染Wolbachia灰飞虱饲喂不同浓度的细胞凋亡抑制剂z-DEVD-fimk后发现,感染Wolbachia的对照组灰飞虱产卵量仍然高于不感染对照组灰飞虱,并且感染Wolbachia的处理组灰飞虱产卵量随细胞凋亡抑制剂浓度增加而减少。感染Wolbachia的灰飞虱食用抑制剂浓度达到 1.50 μg/μl的饲料后平均产卵量仅有11 ±3粒;并且食用细胞抑制剂的灰飞虱Caspase-3-like mRNA以及VgmRNA表达水平要低于对照组。同时,Caspase-3-like蛋白酶活性检测结果也表明,抑制剂z-DEVD-fimk对灰飞虱细胞凋亡具有显著的抑制作用。4.灰飞虱细胞凋亡caspase基因灰飞虱中4条细胞凋亡caspase基因被鉴定。Lscaspase-1 a和Lscaspase-1 c具有较高的同源性,序列分析发现这两条基因与昆虫中caspase-1s基因同源性很高。另外两条带有长原域的caspase同源基因Lscaspase-Nc与Lscaspase-8也被鉴定。Lscaspase-Nc基因与昆虫中的caspase-Nc基因相似性高;Lscaspase-8与部分昆虫中的caspase-8具有较高的相似性。对灰飞虱不同羽化时期卵巢内Wolbachia滴度与caspase细胞凋亡基因及Vg基因表达水平关系进行研究发现,三者随着寄主卵巢的发育具有相同的变化趋势。同时,对这4条细胞凋亡caspase基因进行特异性RNAi干扰后结果表明,细胞凋亡在共生菌Wolbachia增强寄主灰飞虱产卵的过程中具有一定作用。5.Wolbachhia在灰飞虱卵巢中的转移路径运用免疫组化方法对灰飞虱不同发育阶段卵巢中共生菌Wolbachia进行定位,以期了解Wokbachia在灰飞虱卵巢中转移路径以及垂直传播机制。研究结果表明,Wolbachia可能在卵巢管外与寄主Vg蛋白结合,通过端丝进入卵巢同时侵染生殖区前端的干细胞。位于卵巢干细胞的Wolbachia随着干细胞分化进入卵巢生殖区内的所有细胞。在这个过程中,部分Wolbachia进入卵母细胞,实现早期侵染。处于滋养细胞内的Wolbachifa随着卵的发育通过胞间连丝与Vg蛋白细胞质流一起转移至发育中的卵。随着卵的发育成熟,胞间连丝消失,共生菌Wolbachia向卵内的转移终止。RNAi干扰Vg基因的灰飞虱卵巢中Wolbachia的分布对结果进行了进一步验证。相对于对照组RNAi干扰GFP基因的灰飞虱,RNAi干扰Vg基因显著影响灰飞虱卵巢管中Wolbachia的滴度以及分布。RNAi干扰Vg基因后,Wolbachia呈无规则分布于整个卵巢,并且Wolbachia滴度显著低于对照组。实验结果表明,寄主Vg蛋白在共生菌Wolbachia侵染寄主灰飞虱卵巢过程中具有特殊的作用。