来源于囊胚内细胞团的ES细胞和来源于PGC的EG细胞能在体外无限扩增并保持它们的分化潜能.在合适的培养条件下,ES/EG细胞可以分化成各种细胞类型,通过囊胚注射等方法可以形成嵌合体动物并参与生殖系细胞的形成.因此,ES/EG细胞在细胞分化、胚胎发育、基因调节、家畜改良、转基因动物的生产以及移植治疗等方面具有重要的研究和应用价值.该论文研究了不同饲养层类型对分离培养猪胚胎干细胞的影响,并探讨了用体内囊胚、体外生产胚胎和早期猪胎儿的PGC分离培养猪胚胎多能性干细胞的方法和可能性.分别采用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、猪胚胎成纤维细胞(PEF)和STO细胞制作饲养层来培养猪囊胚及其内细胞团(ICM),经2-5d培养后,囊胚在三种饲养层上形成原代类ES细胞集落的形成率差别不明显;ICM在三种饲养层上形成原代类ES细胞集落的形成率分别为:75％,65％和20％,最高传代数分别是9代,5代和1代.用免疫荧光法对三种饲养层细胞的微管进行染色,结果显示STO细胞的荧光分布远低于MEF和PEF,证明前者的微管数量远低于后两者,提示该实验室使用的STO细胞可能已经衰老,已不适合用于制作饲养层来培养ICM和ES细胞,这与上述培养结果相符.这些结果说明MEF是相对较好的饲养层细胞,同时也提示了饲养层细胞微管数量的多少与原代类ES细胞集落的产生与穿代存在一定的正相关.因此,微管数量可以作为推测饲养层细胞质量的指标之一.以中国实验用小型猪为实验材料,收集7-9d的猪囊胚,部分囊胚用酶消化法分离ICM,剩余囊胚(20)和分离到的ICM(28)分别接种到MEF饲养层上进行培养.研究发现酶消化法分离ICM不会对ICM细胞造成损伤,所有的ICM都能贴附于饲养层上,其中68％的ICM能形成原代类ES细胞集落,高于全胚培养产生原代类ES细胞集落的形成率(28％),并得到两株传6—9代的类ES细胞.这些类ES细胞集落形态上类似于小鼠ES细胞克隆:集落边界明显,形似岛丘或鸟巢状,细胞之间界限不清,胞体较小,核较大,表达AP活性.当把这些类ES细胞培养在没有饲养层和LIF的培养基中或延时培养时,能分化形成不同的细胞类型,包括上皮样细胞、神经样细胞和平滑肌样细胞;而悬浮培养时能形成类胚体.这些结果提示ICM培养法优于全胚培养法,该实验得到的类ES细胞具有多能性,猪的ES细胞系是可以在该实验培养条件下建立的.在实验中我们还探索了一种新的分离猪囊胚内细胞团的方法—酶消化手术法,首次发现了呈"凹"形扩展的非集落式生长的类ES细胞,提示胚胎干细胞可能存在多种生长方式,而不总是单一的克隆式生长方式.利用体外生产的胚胎分离培养多能性干细胞具有更为重要的研究和应用价值.该实验采用猪卵母细胞的体外成熟和体外受精技术来生产猪胚胎,收集不同时期的胚胎培养在含有干细胞培养液和MEF饲养层的培养孔中,只有囊胚期的胚胎产生类ES细胞集落.这些集落传代后有新的集落产生,但传到第4代时没有观察到有新的类ES集落生成.这些集落具有ES细胞形态,能表达AP活性,细胞培养在没有饲养层和不含LIF的培养基中会分化成多种细胞类型,悬浮培养能形成类胚体.这些结果提示用体外生产的猪胚胎可以培养到类ES细胞,这些细胞具有多能性.作为培养多能性干细胞的重要细胞来源之一原始生殖细胞(PGC)一直是人们关注和研究的焦点之一.该实验收集25-30日龄的猪胎儿,先通过AP染色法快速定位PGC,再以机械法从生殖嵴部位分离出PGC,经消化离散后培养在铺有MEF饲养层和含有干细胞培养液的培养孔中.经2-4天培养后出现大量原代类EG细胞集落,并表达AP活性,但大多类EG细胞集落传3-4代后分化消失.以上结果提示以MEF制作饲养层,以中国实验用小型猪的7-9日龄囊胚,体外生产的猪胚胎以及25-30日龄胚胎的PGC为实验材料,在进一步优化培养条件和传代方法的基础上是有可能建立具有分化潜能和无限扩增能力的猪ES/EG细胞系.