铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科、石斛属、多年生附生草本植物,其种子萌发需经原球茎发育进程而形成完整植株,根据其原球茎的形态特征可将该进程划分为七个时期,分别为种胚活化期(P1)、原球茎形成期(P2)、原分生组织形成期(P3)、顶端分生组织形成期(P4)、椭球形原球茎时期(P5)、叶原基维管系统形成(P6)和根端分生组织形成(P7)。氨基酸转运蛋白(Amino acid transporter,AAT)是高等植物中介导氨基酸跨膜转运的一种膜蛋白,主要包括氨基酸多胺胆碱转运蛋白家族(APC)和氨基酸/生长素渗透酶家族(ATF)。APC家族共含有两个亚家族,包括阳离子氨基酸转运蛋白(CATs),L-型氨基酸转运蛋白(LATs);ATF家族包括氨基酸通透酶(AAPs),赖氨酸和组氨酸转运蛋白(LHTs),脯氨酸转运蛋白(ProTs),生长素转运蛋白(AUXs),氨基丁酸转蛋白(GATs),芳香族和中性氨基酸转运蛋白(ANTs)六个亚家族。本研究以铁皮石斛作为材料,通过生物信息学分析、转录组数据分析以及实时荧光定量PCR等方法,探究DoAAT家族在铁皮石斛原球茎发生过程中的作用。主要结果如下:(1)本研究通过Blast等方法自铁皮石斛全基因组中鉴定出22个DoAAT超家族成员,其中DoCAT 5个、DoAAP 6个、DoLHT 3个、DoProT 1个、DoAUX 2个、DoGAT1个、DoANT 1个、DoLAT 3个。APC家族中两个亚家族序列都具有一个或以上的AA permease结构域,除此之外,CATs还具有一个AA permease C特征结构域;ATF家族中各亚家族基因序列均含有一个AA trans结构域;其中,LHTs还含有一个Trp-Tyr-perm特殊结构域。生物信息学分析表明,各铁皮石斛氨基酸转运蛋白均含有跨膜结构域,且具有不含信号肽,是疏水性蛋白等特性;基因结构中,DoAATs均具有激素响应元件、胁迫响应元件、组织表达元件、结合位点元件、代谢调节元件以及生理作用元件,表明该基因家族对铁皮石斛生长发育起重要作用。系统发育树的结果表明,铁皮石斛氨基酸转运蛋白与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系性最为密,这符合其同为兰科植物的特性。(2)通过高通量测序技术对铁皮石斛原球茎P1-P5时期进行二代和三代转录组测序。测序结果分析表明共有19个DoAATs在此时期表达,包括DoCAT 5个,DoLAT 3个,DoAAP 4个,DoLHT 2个,DoProT 1个,DoAUX 1个,DoGAT 1个,DoANT-like2个。结构分析表明该家族成员基因序列具有可变剪接、SSR等结构,其中,可变剪切结构使得该基因具有不同的剪切异构体。GO分析表明该家族成员是各种细胞膜结构的组成成分,参与氨基酸的跨膜转运,DoCAT主要介导赖氨酸、精氨酸、谷氨酸的转运,DoAAP家族主要参与酸性和中性氨基酸的转运,DoProT2参与脯氨酸的转运,DoGAT1参与氨基丁酸的转运。另外,该家族蛋白还与铁皮石斛生长发育过程中某些生理作用有关,如毒素分解、超敏反应的调节、细胞程序性死亡的负调控等。KEGG分析表明DoAUX参与植物激素信号转导途径,调节激素相关的生长和发育。差异基因表达结果表明DoAAP2、DoAAP4、DoLHT1在P1-P5时期表达量均较高,DoCAT1、DoLHT8、DoGAT1在P3-P5时期表达量较低,甚至不表达。(3)本文通过荧光定量PCR对DoAAP亚家族基因在铁皮石斛种胚发育各个时期、各组织以及在寒冷和干旱胁迫下的相对表达量进行分析。结果表明DoAAP家族基因在铁皮石斛原球茎发育的不同时期均表达,所有基因在P1-P6时期均存在先上调后下调的过程,且在P7时期表达量升高。冷和干旱胁迫下,DoAAP亚家族的表达模式相同,DoAAP2、DoAAP3属于正调控响应;DoAAP4、DoAAP7、DoAAP8属于负调控响应;DoAAP6表达情况无规律,冷胁迫条件下的表达量均小于对照样本的表达水平且上下波动,干旱胁迫时,DoAAP6仅在处理72h时表达量高于对照样本,其他时间段表达量较低。综上所述,氨基酸转运蛋白在铁皮石斛种子发育P1-P5时期可介导氨基酸跨膜转运,不同亚家族所转运的氨基酸不同,为形成各种蛋白质提供原料,对种子发育过程中原分生组织、顶端分生组织等结构的形成具有重大功能。其中,DoAAP亚家族表达模式研究表明,该亚家族成员在P7时期表达量均较高,表明其在根端分生组织形成时期转运氨基酸活性最强,预示对根的形成和生长发挥着极大作用。此外,DoAAT所参与的生理过程,如毒素分解等,表明该家族为铁皮石斛正常发育提供保障。