第一部分SPINK1基因突变在慢性胰腺炎人群中的分布及对病程的影响目的:慢性胰腺炎（chronic pancreatitis,CP）是由遗传及环境等因素造成的胰腺组织进行性破坏的炎症性疾病,严重危害人民生活质量及身体健康,社会经济负担大,明确其致病机制对疾病的防治尤为重要。遗传因素在CP的发生和发展中起重要作用,其中SPINK1基因突变在我国CP中占主导地位,而目前对SPINK1基因在CP中的作用尚有分歧。因此本研究将基于独立的、大样本中国CP人群,明确SPINK1基因对我国CP起病及疾病进程的影响,为后续SPINK1基因靶向治疗奠定理论基础。方法:研究对2010年至2015年期间前瞻性纳入的1061例中国CP患者和1196例健康对照人群进行分析。患者签署知情同意书后采集患者信息并留取外周血标本。将患者分为四组:酒精性CP（alcoholic CP,ACP）,低中等剂量饮酒性CP（light-tomoderate alcohol consumption CP,LM-CP）,早发型特发性CP（early onset ICP,EOICP）和晚发型特发性CP（late-onset ICP,LO-ICP）。提取外周血DNA并进行易感基因靶向测序,评估致病突变对各组CP患者起病年龄及疾病进程的影响。结果:SPINK1是本队列中最常见的突变基因,在EO-ICP中携带率高达59.7%,在LO-ICP、LM-CP与ACP中的携带率分别为25.5%、26.0%和27.2%,其中最主要的是SPINK1 c.194+2T＞C功能缺失型突变（超90%）。相较于未携带基因突变的患者,携带SPINK1突变的患者起病年龄在各组均显著提前;在疾病病程方面,SPINK1基因突变与饮酒相互促进,增加患者胰管结石（LM-CP伴SPINK1突变:OR=2.63,95%CI 1.35至5.12;ACP伴SPINK1突变:OR=3.27,95%CI 0.39至27.60）、胰腺假性囊肿（LM-CP伴SPINK1突变:OR=1.16,95%CI 0.63至2.11;ACP伴SPINK1突变:OR=2.13,95%CI 0.66至6.84）和反复发作急性胰腺炎型腹痛（LM-CP伴SPINK1突变:OR=3.63,95%CI 2.19至6.01;ACP伴SPINK1突变:OR=8.21,95%CI 3.44至19.60）的发生风险。结论:功能缺失型SPINK1是我国CP人群中最常见的突变基因,在早发型CP中尤为高频。SPINK1基因突变不仅加速CP的起病,且与酒精环境因素协同,增加胰管结石、胰腺假性囊肿和疼痛的风险,在CP发生发展中起到关键作用。第二部分内源性过表达SPINK1基因对胰腺腺泡细胞在雨蛙素刺激下的保护作用研究目的:由于CP尚无有效的治疗方式,真正意义上针对病因的治疗仍有待探索。第一部分结果表明SPINK1功能缺失型基因突变是我国CP最为显著的遗传学背景,SPINK1蛋白正是抑制胰酶激活的“第一道防线”,因此在胰腺中特异性过表达正常SPINK1蛋白,理论上是我国CP人群基因治疗的有效方式。由于目前外源补充人SPINK1蛋白的方法难以长期维持作用,本部分将体外探索内源性过表达正常SPINK1基因对防治CP发作的有效性。方法:以携带GFP标签和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体介导正常人SPINK1基因的编码序列,根据预实验测定的感染复感染指数（multiplicity of infection,MOI）将过表达SPINK1的病毒感染大鼠胰腺腺泡细胞AR42J。通过嘌呤霉素筛选获得稳定表达SPINK1的胰腺腺泡细胞株。通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白印迹法确定SPINK1在胰腺腺泡细胞中表达;在培养基中加入100 n Mol/L雨蛙素,于2h、4h、6h、8h分别收取上清和细胞沉淀,检测细胞上清淀粉酶水平和细胞自噬指标表达情况,观察稳定表达SPINK1的细胞株在雨蛙素刺激后对胰腺炎的保护作用。结果:与未感染组和感染空载体组相比,感染过表达SPINK1慢病毒载体的AR42J细胞SPINK1 m RNA和蛋白表达水平显著增高（P＜0.05）。过表达SPINK1慢病毒载体的AR42J细胞SPINK1 m RNA及蛋白表达量随雨蛙素刺激时间延长而呈逐渐的上升趋势,且均显著高于未感染组和感染空载体组的表达;过表达SPINK1的AR42J细胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-βm RNA表达量,在雨蛙素刺激后2h、4h、6h、8h均显著低于未感染组和感染空载体组AR42J细胞。Western blot结果显示,自噬指标LC3-Ⅱ在过表达SPINK1的AR42J细胞中的表达显著低于未感染组（P＜0.05）。各组AR42J细胞上清淀粉酶水平呈现随时间推移而逐步上升的趋势,但过表达SPINK1的胰腺腺泡细胞上清淀粉酶表达水平均显著低于未感染组和感染空载体组AR42J细胞（P＜0.05）。结论:内源性过表达SPINK1的AR42J细胞能够稳定表达SPINK1蛋白,显著减轻胰腺腺泡细胞的炎症反应以及缓解自噬,减少细胞上清淀粉酶水平,发挥抑制胰腺炎的作用。本部分体外实验证明内源性过表达SPINK1基因对预防胰腺腺泡细胞胰腺炎急性发作有效,或可成为应用于临床上CP基因治疗的手段。第三部分重组AAV8介导的胰腺特异性表达SPINK1基因防治慢性胰腺炎的实验研究目的:重组腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是将外源性正常SPINK1基因安全有效地导入人体的优选载体。本研究采用改造后的重组AAV8型载体介导正常SPINK1基因,在体内小鼠模型中验证该载体的感染效率和安全性,以及探索该载体能否在CP急性发作以及疾病进展中起到保护作用。方法:（1）重组AAV8-SPINK1载体在小鼠中的感染效率及安全性采用8周龄健康成年野生型C57BL/6小鼠,以腹腔注射法导入携带GFP标记的重组AAV8-SPINK1载体。设定病毒滴度梯度实验,评估AAV8感染的最佳滴度及最佳表达时间,并通过活体成像仪检测胰腺以及心脏、肝脏、脾、肺、肾脏等重要脏器的自荧光强度评估感染效率。于感染最佳条件下处死小鼠,取血清检测重组AAV8-SPINK1载体感染后小鼠肝肾功能以及胰腺淀粉酶指标,取胰腺组织进行H＆E染色观察形态,评估重组AAV8-SPINK1载体的安全性。（2）重组AAV8-SPINK1载体对防治小鼠慢性胰腺炎的有效性根据是否注射病毒将C57BL/6小鼠分为三组:重组AAV8-SPINK1载体感染组、重组AAV8-空载体感染组、以及生理盐水注射对照组。以100μg/kg浓度的雨蛙素对小鼠进行腹腔注射,每小时注射1次,连续7次注射构建胰腺炎急性发作模型;以100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg雨蛙素进行梯度注射,评估重组AAV8-SPINK1感染组小鼠对雨蛙素的敏感性;以50μg/kg浓度的雨蛙素对小鼠连续给药4周,每周注射3次构建CP模型。取小鼠血清检测炎症因子、淀粉酶和胰酶水平,评估胰腺炎症程度;取小鼠胰腺组织进行H＆E病理染色和MASSON染色及评分、胰腺组织超微结构观察、免疫荧光法检测自噬指标LC3-Ⅱ、TUNEL染色检测凋亡因子,评估胰腺组织水肿或萎缩程度、自噬及凋亡水平,探寻重组AAV8-SPINK1载体对防治胰腺炎急性发作及CP进程的有效性。结果:（1）重组AAV8-SPINK1载体在小鼠中的感染效率及安全性在2×1011vg/animal病毒滴度下重组AAV8载体的表达水平最高,GFP荧光在注射后第4周荧光强度最佳,且重组AAV8载体能够靶向感染胰腺而不影响其他重要脏器。感染重组AAV8载体小鼠的肝功能指标（ALT、AST、ALP、LDH、TP、ALB）、肾功能指标（BUN、Cr）以及胰腺血清淀粉酶水平与注射生理盐水组小鼠均基本持平,属于正常范围之内,且H＆E染色示胰腺组织排列正常,腺泡细胞未见水肿、坏死、出血灶,表明重组AAV8载体感染胰腺组织安全佳。（2）重组AAV8-SPINK1载体对防治小鼠慢性胰腺炎的有效性胰腺炎急性发作模型结果显示,与生理盐水注射组和AAV8空载体感染组小鼠相比,重组AAV8-SPINK1载体小鼠的血清炎症因子、淀粉酶及胰蛋白酶水平显著较低,胰腺组织水肿程度、炎性渗出、胰腺腺泡细胞坏死水平显著缓解;透射电镜结果显示,对照组小鼠细胞内的粗面内质网显著扩张、胞浆内可见大量自噬性空泡,而重组AAV8-SPINK1感染组小鼠胰腺腺泡细胞形态基本正常;自噬指标LC3-Ⅱ以及TUNEL检测的凋亡因子水平在对照组小鼠胰腺中的表达量显著高于重组AAV8-SPINK1载体感染组小鼠。重组AAV8-SPINK1载体可有效降低小鼠对雨蛙素的敏感性,在250μg/kg雨蛙素注射时胰腺炎表型以及自噬、凋亡指标才较为显著。在CP模型中,重组AAV8-SPINK1感染组小鼠血清炎症因子和淀粉酶水平显著低于生理盐水组和重组AAV8空载体组小鼠;组织学染色示胰腺组织排列紧密,纤维化程度以及胰腺腺泡细胞萎缩程度显著较轻;重组AAV8-SPINK1亦可有效降低CP模型小鼠胰腺组织自噬和凋亡程度,控制CP疾病病程进展。结论:重组AAV8-SPINK1载体可以安全有效地用于小鼠体内,对其他重要脏器侵入量少,在胰腺中可特异性、靶向性、长期性表达。重组AAV8-SPINK1载体可成功预防CP的急性发作、降低胰腺炎症反应、缓解胰腺组织纤维化、减轻胰腺腺泡细胞的自噬及凋亡水平,有效地控制CP疾病病情进展,为实现CP患者精准医疗提供临床前应用的关键性证据。