【摘 要】
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稀有人参皂苷Compound K(C-K)在抗肿瘤等方面的独特效果受到国内外的关注。但是人参皂苷C-K在自然界含量极低,限制了人参皂苷C-K的应用需要。为此,利用生物转化法来制备稀有
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稀有人参皂苷Compound K(C-K)在抗肿瘤等方面的独特效果受到国内外的关注。但是人参皂苷C-K在自然界含量极低,限制了人参皂苷C-K的应用需要。为此,利用生物转化法来制备稀有人参皂苷C-K已成为生物医药研究热点之一。本实验以来自SulfolobuS Solfataricus的β-糖苷酶(LacS)为基础,筛选高效催化主要人参皂苷Rbl为C-K的β-糖苷酶等的工业用酶。首先通过易错PCR建立突变文库,然后给予选择压力进行定向筛选,最后对改造后具有优良特性的β-糖苷酶进行酶学性质的表征。理论上LacS催化1分子Rbl生成C-K会产生3分子的还原糖。因此通过DNS法检测还原糖的量来建立高通量的筛选方案,进而筛选出高活性人参皂苷催化酶。实验结果得到一株能够高效催化Rbl变成C-K的优良菌种。异源表达的LacS氨基酸的第218位由缬氨酸(Val)变成了甘氨酸(Gly)。由此将LacS催化Rbl的活性提高了2.5倍。突变后的LacS的最适反应温度也由野生型(WT)的85℃下降到70℃。用0.04mg/ml的突变体LacS在McBuffer缓冲液(pH5.5)溶液中,70℃水浴条件下,可以在1h将3.2mg/m1Rb1消耗完,97%转化为C-K(mol/mol),为最终的工业化生产人参皂苷C-K提供了实验基础。优良的突变体相对于野生型只有一个氨基酸的变化,能充分证明LacS的218位点的氨基酸的变化导致了LacS的三维立体结构发生了改变,这种改变使LacS理化性质发生改变,对底物Rb1的捕获能力或者催化能力增强,从而导致了LacS的催化Rbl活性发生变化。
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