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背景:正己烷作为一种有机溶剂和稀释剂,广泛应用于各个行业,为数百万人的职业健康带来了威胁。流行病学调查显示长期接触正己烷会导致周围神经系统(Peripheral Nervous System,PNS)和中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)多发性神经病变。正己烷的神经毒性作用由其神经毒性代谢物2,5-己二酮(2,5-hexanedione,HD)介导。本课题组前期研究发现HD暴露引起异常的神经电生理变化,包括神经传导速度的减慢和远端潜伏期的延长。正己烷中毒可表现出持续和进行性脱髓鞘。髓鞘的主要功能是提供离子绝缘,加速电脉冲的传导速度。因此,CNS中髓鞘的丢失导致传导阻滞或传导减慢。持续性脱髓鞘最终会导致轴索损伤和运动损伤,感觉和自主神经功能障碍,甚至高度残疾。因此,在病理学中,成功的髓鞘再生和增强的少突胶质细胞生成是功能恢复过程中的关键治疗目标。髓鞘的再生不是由幸存的OLs介导的,而是由新的OLs生成的。用于髓鞘修复的新OLs是由成体少突胶质细胞前体细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)产生的,其产生需要成体OPCs的激活,募集和分化。不幸的是,在正常生理条件下和对脱髓鞘损伤的反应中,增殖祖细胞通常大量围绕在CNS病变的周围,但往往不能使稀疏轴突重新髓鞘化。因此,开发一种髓鞘再生疗法,使OPCs更易于或更倾向于分化为OLs,从而改变长期脱髓鞘病变的命运显得尤为重要。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能和旁分泌能力的一种干细胞。双重性质使得这些细胞更有效且更适合于开发用于神经变性疾病的细胞疗法。BMSCs移植在各种神经退行性疾病的治疗中表现出积极的作用,包括多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS),帕金森病,阿尔茨海默病和多系统萎缩。本课题组以往的研究发现BMSCs在HD诱导的神经病变中具有治疗效果,主要表现在BMSCs移植能有效的减轻HD诱导的神经元损伤和明显的改善运动功能。研究发现,BMSCs能够极大程度的提高分化神经祖细胞髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达水平;BMSCs能够改变海马切片培养中神经祖细胞的少突胶质细胞命运;在体外,BMSCs亦能强烈抑制成体神经祖细胞的星形胶质细胞分化。基于以上研究,不禁让我们想到,BMSCs能否促进HD诱导的受损神经组织OPCs的成熟及向OLs的分化,进而促进髓鞘再生,从而来发挥神经保护作用?如果可以,其机制又是什么?这些均为本研究所关注的内容。第一部分:BMSCs对HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生的促进作用。目的:探讨BMSCs移植是否可促进HD暴露大鼠脊髓受损髓鞘再生。方法:将100只大鼠随机分成5组,分别为对照组(Control)、干细胞对照组(BMSCs)、染毒组(HD)、自身修复组(HD+NS)、干细胞干预组(HD+BMSCs)。采用透射电镜、卢卡斯快蓝(luxol fast blue,LFB)染色、砂罗铬花青(solochrome cyanine,SC)染色及苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色法观察HD暴露大鼠BMSCs移植前后髓鞘的变化,采用免疫荧光染色及Western Blot法检测HD暴露大鼠BMSCs移植前后MBP的表达。结果:BMSCs移植后,透射电镜、LFB染色、SC染色及HE染色能明显的观察到HD暴露大鼠脊髓受损髓鞘的再生,差异有统计学意义(P<0.05);BMSCs移植组MBP蛋白的表达及免疫荧光强度明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.BMSCs可促进HD暴露大鼠脊髓受损髓鞘的再生;2.BMSCs对HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生的促进作用可能是通过促进少突胶质细胞成熟实现的。第二部分:BMSCs对HD暴露大鼠脊髓OPCs分化及成熟的促进作用及发状分裂相关增强子1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)的作用。目的:探讨BMSCs是否是通过促进OPCs分化和成熟来促进HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生的,以及在此过程中Hes1发挥怎样的作用。方法:将100只大鼠随机分成5组,分别为对照组(Control)、干细胞对照组(BMSCs)、染毒组(HD)、自身修复组(HD+NS)、干细胞干预组(HD+BMSCs)。采用免疫荧光染色法检测HD暴露大鼠BMSCs移植前后NG2和MBP的荧光表达;实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测脊髓组织Hes1m RNA表达;Western Blot法检测MBP及Hes1蛋白的表达。体外培养OPCs,分成3组,分别为对照组(Control)、染毒组(HD)和干细胞干预组(HD+BMSC-CM),光镜下观察HD染毒OPCs给予BMSC-CM前后及OPCs Hes1过表达前后对OPCs成熟和分化的影响;Western Blot法检测给予BMSC-CM前后MBP及Hes1蛋白的表达;Western Blot法检测Hes1过表达前后MBP蛋白的表达;免疫荧光法检测Hes1过表达前后MBP的荧光表达。结果:BMSCs移植可减少大鼠脊髓组织HD染毒所致的NG2荧光表达增强,增加HD所致的MBP荧光表达减弱,差异有统计学意义(P<0.05);BMSCs移植可增加大鼠脊髓组织HD染毒所致的MBP蛋白表达减少,减少HD染毒所致的Hes1m RNA及蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM可明显的增加HD染毒所致的成熟OLs减少,减少HD染毒所致的OPCs及死亡细胞的增加,OPCs Hes1过表达后,BMSC-CM的这种作用减弱,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM可增加HD染毒所致的OPCs MBP蛋白表达减少,减少HD染毒所致的OPCs Hes1蛋白表达增多,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM可明显增强HD染毒所致的OPCs MBP荧光强度减弱,Hes1过表达后,BMSC-CM的这种作用减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.BMSCs移植可促进HD暴露大鼠脊髓髓鞘OPCs的分化及成熟;2.Hes1负调控BMSCs对HD暴露大鼠脊髓髓鞘OPCs成熟的促进作用;3.BMSCs通过降低Hes1的表达来发挥对HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生的促进作用。第三部分:BMSCs通过TNFα/Rel B-Hes1途径促进HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生。目的:探讨BMSCs对HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生促进作用的机制。方法:q RT-PCR及Western Blot法检测各组大鼠脊髓组织及各组OPCs Jagged1、Notch1、Notch胞内段(Notch intracellular domain,NICD)及无毛重组结合蛋白抑制剂(recombining binding protein suppressor of hairless,RBPJ)m RNA及蛋白的表达;qRT-PCR及Western Blot法检测大鼠脊髓组织Rel B m RNA及蛋白的表达,检测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)m RNA及TNFα蛋白表达;Western Blot法检测OPCs TNFα蛋白表达;TNF干预后,光镜下观察对OPCs成熟的影响;免疫荧光染色检测对MBP阳性细胞数的影响;Western Blot法检测对MBP、Hes1及Rel B蛋白表达的影响;OPCs Rel B过表达后,光镜下观察对OPCs成熟的影响;免疫荧光染色检测对MBP阳性细胞数的影响;Western Blot法检测对MBP及Hes1蛋白表达的影响;Western Blot法检测给予BMSC-CM后OPCs NGF及p-Trk A/Trk A蛋白的表达;Western Blot法检测给予NGF及Trk A阻断剂干预后TNFα蛋白的表达。结果:BMSCs移植前后HD暴露脊髓组织/HD染毒OPCs Jagged1、Notch1、NICD及RBPJ m RNA及蛋白表达无明显不同,差异无统计学意义(P>0.05);BMSCs移植可显著降低HD暴露所致的大鼠脊髓组织TNF及Rel B m RNA及蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM可显著减少HD染毒所致的OPCs TNFα蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM可显著增加HD染毒所致的成熟OLs减少,减少HD染毒所致的OPCs及死亡细胞的增加,TNF干预后,BMSC-CM的作用减弱,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM可显著增强HD染毒所致的OPCs MBP荧光强度减弱及MBP蛋白表达减少,TNF干预后,BMSC-CM的作用减弱,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM对OPCs成熟的影响、对MBP荧光染色及蛋白表达的影响、对Hes1蛋白表达的影响,在OPCs Rel B过表达后显著减弱,差异有统计学意义(P<0.05);BMSC-CM干预后,OPCs NGF及p-Trk A蛋白表达增强,差异有统计学意义(P<0.05);NGF干预及Trk A激活被阻断后,TNFα蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.BMSCs对HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生的促进作用与Notch信号通路无关;2.BMSCs通过TNFα/Rel B-Hes1途径促进HD暴露大鼠脊髓髓鞘再生;3.BMSCs对髓鞘再生的促进作用可能是由NGF介导的。