胚胎质量是影响体外受精(in vitro fertilization,IVF)结局的重要因素。而胚胎在生长发育过程中所处的局部微观环境对胚胎质量发挥着决定性作用。胚胎培养微环境最主要的构成部分就是体外培养体系。如何建立最适宜胚胎生长发育的体外培养体系,是目前辅助生殖技术(assisted reproductive technologies,ART)领域研究的热点之一。　　 近些年来,随着对培养微环境研究的进一步深入和认识的逐渐加深,体外培养体系被不断地改良更新。目前主要采用的是矿物油或者石蜡油覆盖的微滴培养系统培养胚胎。国内外许多研究证实哺乳动物胚胎体外培养时,群组法培养要比单胚法培养获得更高质量的胚胎。然而发生机制仍然不清,可能与胚胎发育过程中自身分泌因子的相互作用有关。然而这些研究大多是数十年前进行的,最近几年培养基和培养体系都有了很大幅度的更新,体外培养胚胎质量和妊娠结局得到很大的改善。在现有的新培养条件下,体外受精胚胎是单独培养或还是群组培养,胚胎质量是否会受到培养体积和密度的影响等依然不明。　　 尽管数量众多的胚胎群组共同培养可能有助于胚胎发育,但这仅仅是用于实验研究,并且群组培养无法追踪个体胚胎的发育情况。商业化的培养系统或者人胚培养系统多要求胚胎单独培养或者小数量胚胎群组培养。为了克服这些问题,Vaita等开发了微孔(the-well-of-the-well,WOW)培养系统,为单独培养的胚胎提供了半开放的培养微环境。微孔培养系统不仅稀释了胚胎发育过程中堆积的代谢产物的毒性作用,而且还将胚胎自分泌或者旁分泌的生长因子聚集在每个微孔内的胚胎周围,进而促进胚胎发育。目前关于微孔系统应用于胚胎培养的研究相对较少,并且多集中于单微滴多微孔多胚胎培养研究,单微滴单微孔单胚胎培养未见报道,特别是对于超微滴体积下微孔培养系统对于胚胎发育的影响、微孔培养系统对玻璃化冷冻前后胚胎细胞凋亡的影响未见报道。　　 从卵巢中获取未成熟卵,在体外适宜的微环境和培养条件下培养成熟,从而具备受精和胚胎发育能力,即为卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)技术。基础研究和临床实践发现,IVM来源的胚胎质量差,囊胚形成率低,植入能力下降,妊娠结局欠佳。究其原因,可能与卵母细胞在体外培养时胞核和胞浆成熟不同步、卵子质量较差有关。在研究中发现,卵母细胞和其周围的颗粒细胞通过内分泌、自分泌、旁分泌的方式相互影响,相互作用。颗粒细胞分泌一些可溶性的营养物质促进胞核和胞质的成熟。是否可以利用WOW系统体外培养未成熟卵子以提高卵子质量依然不明确,相关研究未见报道。　　 微滴法群组培养有利于提高胚胎的发育潜能,但是该培养方法无法追踪胚胎的个体发育,同时过高的胚胎密度也容易导致代谢产物的堆积而增加培养微滴的毒性。微孔系统培养仍处于实验研究阶段,培养条件仍需要摸索。而且目前商品化的微孔培养用皿形式单一、规模较小,因此大多数生殖中心仍选择单胚微滴法培养人的胚胎。传统的单胚微滴法培养面临着很多挑战,长时间的精卵孵育可以导致许多毒性物质的堆积,阻碍早期胚胎的发育。许多研究提出,IVF技术改良之一的选择就是缩短受精时间,从16-18小时缩短至1-4小时。对于缩短精卵共孵育时间是否有利于胚胎发育仍存在争议。　　 本研究通过改变小鼠早期胚胎在微滴培养系统中的微滴体积、胚胎密度观察评估胚胎发育结局;微孔培养系统培养早期胚胎获得囊胚行玻璃化冷冻,观察冷冻前后囊胚细胞凋亡率的变化并评估技术安全性;微孔系统培养未成熟卵子并进行后续胚胎培养,观察评估微孔系统对卵子和胚胎的发育潜能的影响;人胚胎单胚培养系统中缩短精卵共孵育时间观察胚胎发育和妊娠结局等探索不同的体外培养体系对胚胎发育的影响。经查新未见相同报道。　　 第一部分:不同体积和胚胎密度的微滴和微孔培养系统对早期鼠胚发育的影响　　 研究目的:　　 探讨早期小鼠2细胞胚胎的最佳培养微滴体积和胚胎密度,并评估胚胎共培养时间以及WOW培养系统对胚胎质量的影响研究方法:　　 (1)9个/微滴2细胞鼠胚分别在6.25、12.50、25.00和50.00μl微滴中培养;(2)3、6、9和12个2细胞鼠胚在50μl微滴中培养;(3)9个/微滴2细胞胚胎在50μl的微滴中共培养0h、24h、48h、72h、96h;(4)9个/微滴2细胞胚胎分别在50μl微滴和WOW系统中培养,单个鼠胚分别在5.5μl的微滴和WOW系统中培养。(5)单个2细胞鼠胚在1、2、5.5μl体积的WOW系统中培养。所有分组比较囊胚形成率、孵出率和囊胚细胞数目。　　 结果:　　 9个2细胞胚胎在50μl微滴中培养囊胚形成率最高(84.7％)。与群组培养相比,单个胚胎培养囊胚形成率降低。胚胎共培养72-96h囊胚形成率增高,96h囊胚率为84.7%。与微滴法相比,单个胚胎在WOW系统中培养囊胚形成率无明显差异。但群组培养的囊胚细胞数目明显高于单个胚胎培养。另外,单个胚胎在WOW中培养获得囊胚细胞数目明显高于微滴法。单WOW系统体中微滴积缩小至1-2μl,囊胚形成率未发明显差异,但是囊胚孵出率、细胞总数明显增高。　　 结论:　　 50μl微滴9个2细胞胚胎是群组培养的最佳培养体积/密度。胚胎共同培养超过72h有利于改善胚胎发育潜能。50μl的WOW系统能够改善胚胎质量并追踪个体胚胎发育,但是仍不能克服单胚发育的缺陷。微滴体积减少至1μl时有助于提高单独培养胚胎的发育潜能。　　 第二部分:微孔培养系统对小鼠囊胚玻璃化冷冻前后的细胞凋亡影响和技术安全性评估　　 研究目的:　　 通过比较群组培养系统和单胚培养系统、微滴法和WOW法获得的囊胚玻璃化冷冻前后的凋亡率的比较来判断WOW培养系统对胚胎质量和冷冻耐受力的影响。　　 研究方法:　　 第一部分实验获得群组培养、单胚培养、微滴法和WOW法的囊胚一部分行脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling,TUNEL)染色,另一部分囊胚行玻璃化冷冻,解冻复苏后孵育3-4h、6-8h、16-18h、24h,行TUNEL染色。比较细胞凋亡率。　　 结果:　　 单微滴群胚微孔培养法与其他各组相比,各发育阶段囊胚细胞凋亡率明显较低。群组法WOW系统和非-WOW系统扩张期囊胚细胞凋亡率(10.3±3.0)%、(12.6±1.9)%明显低于单胚培养组。解冻后完全扩张少于8h的囊胚细胞凋亡率随孵育时间延长而无明显变化。而完全扩张延迟超过8h的囊胚在培养16-18h、24h后细胞凋亡率(14.2±1:4.9)%、(14.2±3.3)%明显增加。移植玻璃化冷冻解冻后的WOW法获得的囊胚妊娠后出生小鼠体重各组无明显差异。子代雌鼠获卵数、IVF受精率、囊胚形成率、孵出率无明显差别。　　 结论:　　 WOW培养系统有利于改善胚胎质量和提高囊胚冷冻耐受力,囊胚解冻后完全扩张延迟超过8h胚胎细胞凋亡率增加,胚胎发育潜能差。WOW法培养胚胎联合玻璃化冷冻胚胎是安全有效的,对子代特别是雌鼠生殖能力无不良影响。　　 第三部分:颗粒细胞、成熟时间及微孔系统对卵子体外成熟及后续胚胎发育的影响　　 研究目的:　　 通过比较颗粒细胞、卵子成熟时间和体外培养系统对体外成熟卵子质量、受精能力、胚胎发育潜能的影响,探讨未成熟卵子体外成熟和后续胚胎发育的最佳培养微环境。　　 研究方法:　　 (1)240枚未成熟卵子随机分为无颗粒细胞体外成熟组和有颗粒细胞体外成熟组,行体外成熟、受精、胚胎培养;(2)282枚未成熟卵子分为24h培养成熟组和48h培养成熟组,行体外受精和胚胎培养;(3)259个未成熟卵子分为群组培养组(9个/微滴)和单独培养组(1个/微滴),行体外成熟、受精、胚胎培养。(4)9个未成熟卵子及受精后的2细胞胚胎分别在50μl微滴和WOW系统中培养,单个未成熟卵子及受精后的2细胞胚胎分别在5.5μl的微滴和WOW系统中培养。比较各组囊胚形成率、孵出率和囊胚细胞数目。　　 结果:　　 有颗粒细胞组卵子获得胚胎囊胚形成率(34.0%)和囊胚孵出率(72.2%)明显高于无颗粒细胞组。经24h培养成熟的卵子的胚胎卵裂率(64.6%)、囊胚形成率(37.5%)要明显高于48h者。经群组培养成熟的卵子与单卵培养成熟的卵子相比,成熟率(71.5%)、胚胎卵裂率(60.2%)、囊胚形成率(33.90%)要明显增高。单胚培养组和群胚培养组相比,囊胚形成率明显降低,而囊胚孵出率则无明显差别。群胚培养时,采用WOW系统的囊胚形成率、囊胚孵出率与非-WOW系统没有明显区别。WOW系统中群组培养组的囊胚细胞总数为49.2±9.2,高于单胚培养组的38.2±8.0,在非-WOW系统中群组的43.0±7.7也高于单胚组的34.4±2.3。群组培养WOW系统囊胚细胞总数49.2±9.2明显高于非.WOW系统中的43.0±7.7。内细胞团TE细胞总数37.7±9.2)要明显多于非.WOW系统31.7±7.3。此外,单胚培养WOW系统的囊胚细胞总数49.2±9.2)明显多于非-WOW系统43.0±7.7。相应的WOW系统的ICM/TE(32.6±9.0)%也要高于非-WOW系统(36.8±6.6)%。　　 结论:　　 颗粒细胞有利于提高群组培养的卵子质量改善胚胎发育潜能。卵子体外成熟时间超过24h胚胎质量变差。卵子群组培养有利于提高卵子质量。WOW法有助于促进卵子成熟和胚胎发育,但是仍不能克服单卵、单胚发育的缺陷。　　 第四部分:人单胚培养系统中受精时间对配子受精、胚胎质量和妊娠结局的影响　　 研究目的:　　 评估短时受精技术的优缺点来证实短时受精-单胚培养技术在IVF临床中的益处。　　 研究对象和方法:　　 郑州大学第一附属医院生殖中心的两组女性患者,组Ⅰ,女方年龄<35岁,不孕期限<5年,男方精液常规正常(WHO,1999);组Ⅱ,女方年龄≥35岁,不孕期限≥5年,男方精液常规轻度异常。男方轻度异常,指精子浓度从10×106/mL～20×106/mL,和精子活动率10%～25%,正常精子形态15%～30%(WHO,1999)。　　 分别采用短时受精(4小时)和长时受精(16-18小时)方法。比较两种方法的受精率、优质胚胎率、临床妊娠率、着床率等。　　 研究结果:　　 组1中,两种受精方法的受精率、临床妊娠率、着床率没有明显差别,但短时受精技术的多精受精率(7.3%)要明显高于长时受精组(4.1%)。组2中,短时受精的受精率(62.6%)要明显低于长时受精(68.7%)。短时受精失败后行补救卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)临床妊娠率34.7%,胚胎植入率为24.1%。补救ICSI的正常婴儿活产率32.0%。　　 结论:　　 精卵共同孵育时间不影响受精率、胚胎质量、临床妊娠率和胚胎着床率。然而精子质量差时,受精率会降低。短时受精失败后行补救ICSI是防止受精失败的有效方法。